鸡冠花红双峰双波长光度法测定人血清中总蛋白质

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中国卫生检验杂志２００６年３月第１６卷第３期ｃｈｉｎｅｓｅＪｏｕｍｄ０ｆＨｅａｌｔ｝ＩＬａｂ啪【ｏ叮ｎｃｈｎｏＪｏｇｙ，Ｍａｒ

２００６；Ｖｏｌｌ６

Ｎｎ３

【化学测定方法】

鸡冠花红双峰双波长光度法测定人血清中总蛋白质

王颖臻”，曹秋娥“，丁中涛１

（１．云南大学化学系，云南大学生物制药创新人才培养基地，昆明６５００９ｌ；２昆明师范专科学校，昆明６５００９１）［摘要］

目的：探索一个定量分析蛋白质的新方法。方法：研究发现在ｐＨ２．５左右的Ｂ—Ｒ缓冲溶液中，鸡冠花红与血

清蛋白质在室温下能迅速结合形成玫瑰红色复台物，该复合物在５８５

ｎｍ处有正吸收峰，在５２０册处有负吸收峰。研究

了反应最佳条件，建立丁蛋白质一鸡冠花红双峰双波长光度法测定蛋，’１质。结果：所测蛋白质在７５～４００ｍ∥１１１ｌ与摩尔吸光度有良好线形关系；用于人血清样品中总蛋白的测定，所得结果满意，回收率在９７６２％～１００５３％。结论：本方法

快速、简便、准确廑高、选择性好，生物体液中大部分常见物质均不产生干扰。

［关键词］鸡冠花虹；蛋白质；双峰双波长光度法［中图分类号］０６５７

３

［文献标识码］Ａ［文章编号】１００４—８６８５（２００６）０３—０２９８—０３

在１ｃｍ比色皿中＿Ｆ２１５及２２５ｎｍ她的吸光度值。鸡冠花红：１．Ｏ×ｌｏ‘。ｍ。Ｌ／Ｉ，水溶液。，Ｂ—Ｒ缓冲溶液由浓度均为

Ｏ．０４

蛋白质是生命中的重要物质，它在体液中的含量可作为

人体营养健康、疾病诊断的霞要指标”１，因此蛋白质的定量分

析在生命科学、临床医学和食品分析等方面具有重要意义。目前已有不少方法用于蛋白质的测定，如分光光度法、荧光法、共振瑞利散射法、电化学法和近红外光谱法、液相色谱法、毛细管电泳法等，其巾分光光度法冈其操作和仪器简便、方法快速、准确度和精密度好而被广泛采用”０１。目前，测定蛋白质的光度分析法多依据蛋白质与染料的结合反应”＊’，这一类分析方法不仅简单快速，而且灵敏度高、稳定性好，因此研究报道较多，但以染料结合反应为基础．采用双峰双波长光度法测定蛋白质的报道基本未见：鸡冠花红是一种生物染色剂，作为蛋白质的光度分析染料目前来见报道。本文研究发现，在ｐＨ２．５左右的Ｂ—Ｒ酸性缓冲介质中，鸡冠花红与蛋白质迅速结合，生成的玫瑰红色复合物具有一个正吸收峰和一个负吸收峰，依此建立了一个测定人血清总蛋白的双峰双波艮光度法。该法简便、快速、稳定性和选择性好＝１材料与方法

１

ｍ彬Ｌ的ＨＡｃ、Ｈ，Ｐ０４及ＨｊＢ０１混和溶液通过Ｏ

１ｍｏＶＩ，

Ｈｃｌ或ＮａＯＨ溶液经ｐＨ计调节得到。所有试剂均为分析纯，

实验用水为蒸馏水。１．２实验方法

在ｌＯⅢｌ比色管中，依次加人适量标准蛋白（条件试验中加ＢｓＡ）或样品溶液．ｐＨ

２

５的缓冲溶液２．０１１１ｌ，１

ｏ×

１０～ｍｏＬ／Ｌ的鸡冠花红２．５ｎｄ，用蒸馏水稀释至刻度并摇匀，

用０．５锄比色皿，以试剂空白为参比，分别在５８５ｎｍ及

５２０

ｎｍ处测定体系吸光度Ａ，。，和Ａ５２０，并计算ＡＡ＝Ａ，，一

Ａ踊。

２结果与讨论

２

１吸收光谱

在ｐＨ２．５的Ｂ—Ｒ缓冲溶液中，鸡冠花红溶液为红色，其

吸收峰位于５２｛】ｎｍ处；在鸡冠花红溶液中加入ＢｓＡ后，溶渡由红色变为玫瑰红色，表明鸡冠花红与Ｂｓ＾结合生成了复台物，此复合物在５８５ｎｍ处有一个正的吸收峰，在５２０Ｉｌｍ处有一个负的吸收峰（见图１）。在复台物的最大正吸收波长

５８５

１仪器与试荆

７２２型分光光度计（山东高密分析仪器厂）；ｐＨｓ～２ｃ型精

密酸度计（上海雷磁仪器厂）。１一球蛋白Ｇ（Ｉｇｃ，分子量以

１５０６５

ｎｍ和最人负吸收波长５２０ｎｍ处．体系吸光度与蛋白质的

０００计）为ｓｉ肿ａ公司产品；牛血清白蛋白（ＢｓＡ，分子量以

０００

浓度在一定范围内均有良好的线性关系：为了提高检测体系的灵敏度，因此采用双峰双波长光度法，分别选定５８５ｒｕｎ及

５２０

００【）计）和人血清白蛋白（ＨｓＡ，分子量以６８５００计）为北京

百泰生化技术有限公司产品；胃蛋白酶【Ｐ８ｐ，分子量以３５ｎｍ为测定波长，并用△Ａ（ＡＡ＝Ａ铘一也：ｏ）作为定量参数。

计）、胰蛋白酶（Ｔｒｙ，分子量以２３３００计）及卵蛋白（ＡｌｂｕＩｎｌｎ，分予量以４５０００计）为Ｅ海丽珠东风生化技术有限公司产品。蛋白质的标准溶液均为水溶液，ＩｇＧ、ＢｓＡ及ＨｓＡ的准确浓度分别由它们在２８０ｎｍ处的岛∞ｍ”Ｉ：Ｉ如，１３

ＨｓＡ，５

８；ＢｓＡ，６６；

３决定；Ｐｅｐ及１ｂ的准确浓度则由公式ｃ蛋白ｍ（斗ｇ／

ｍ１）＝ｌ“×（Ａ：。一九Ⅱ）决定，式中Ａ２１５及Ａ：。为蛋白质溶液

［基金项目］云南省人才培引项目（２００４ＰＹ０ｌ一４）；云南省岛校

教学、科研带头人项目皿昆明师专校蕈金资助项目

圈ｌ吸收光谱

［作者简介］千颖臻（１９７２一），女，在职硕ｊ：，讲师，主要从事分

１．鸡冠花红／蒸馏水；２鸡冠花红

２．２适宜反应条件的确立

ｌ缓冲溶液ｐＨ值及用量的选择

ＢｓＡ／鸡冠花红

＋通讯联系人，Ｔｅｌ：０８７１—５０３１０２４；Ｅ圳ｉｌ：ｑｅｃ舯＠ｙ肌ｅｄｕ

子光谱研究。

ｃⅡ

２．２

固定缓冲溶液的用量

中围卫生检验杂志２００６年３月第１６卷第３期ｃｈｌｎｅｓｅ

Ｊ…甜ｏｆＨｅｄｌｈ【曲ｏｍ协ｒｙｎｃｈｎｄｏｇｙ，Ｍａｒ２００６；Ｖｏｌｌ６

Ｎ０３２９９

为２．０柚，在ｐＨ

１．０—６

５范围内改变缓冲溶液ｐＨ，试验了

ｐＨ对蛋白质与鸡冠花红结合反应的影响。结果表明随ｐＨ值的增加，体系在５８５ｎｍ处的正吸收和在５２０ｎｍ处的负吸收以及两波长处吸光度的差值ＡＡ均呈现出先增大后减少的变化趋势。虽然在各蛋白质体系中出现最大吸光度需要的ｐＨ

值有所不同，测定Ｂ姒、ＨｓＡ及Ｉｇｃ的最佳ｐＨ为２．５，测定胃

蛋白酶、胰蛋白酶及卵蛋白的最佳ｐＨ为３．０，但各蛋白质的最佳结合ｐＨ基本上都小丁其等电点（ｐＩ），说明在酸性介质中，鸡冠花红和蛋白质之间可能主要是以静电引力结合，因此，当介质的ＰＨ过高时，蛋白质所带正电荷数目下降；而当ｐＨ过低时，鸡冠花红电离能力降低，带负电荷的数目减少，最终都导致鸡冠花红与蛋白质间的结合能力Ｆ降。因为测定ＢｓＡ、ＨｓＡ及Ｉｇｃ的最佳ｐＨ均为２．５，故实验选用ｐＨ２．５的Ｂ—Ｒ缓冲溶液控制体系的酸度。进一步试验ｐＨ２．５的Ｂ—Ｒ缓冲溶液的用量对体系测定的影响后发现，当其用量为２

０

ＩＩｌｌ时，体系

有最大检测灵敏度，因此，选用缓冲溶液的用量为２

ｏＩＩｌｌ。

２

２．２鸡冠花红用量的影响在０．５—３．０ｍｌ范围内，试验

广１．０×１０

ｍ∥Ｌ鸡冠花红的用量对鸡冠花红一蛋白质体

系测定的影响。结果表明．随鸡冠花红用量的增加，体系在两波长处的吸光度绝对值及△Ａ都是先逐渐增大，随后在其用量位于２．５ｌＩｌｌ时达到最大值，此后进一步增加其用鼍，吸光度逐步卜降。故本实验选择１０×１０～ｍ出Ｌ鸡冠花红溶液的用

量为２．５１１１ｌ。

２２

３反应时间及温度的选择在室温下，鸡冠花红与蛋白

质在ｐＨ２

５的缓冲溶液中立刻结合生成玫瑰红色复合物，体

系吸光度在２．５ｈ内基本不变。进一步试验了温度对反应速度的影响，结果表明至少在２０℃一４５℃范围内，温度对反应几乎无影响。上述实验结果说明该体系反应速度快、稳定性好。

２

２．４表面活性剂的影响试验了不同类型表面活性剂对反

应体系的影响。阳离子表面活性剂如ｃＴＭＡＢ使空白吸光度增加，体系在两个波长处的吸光度绝对值明显下降；阴离子表面活性剂如ｓＤｓ则使空白的吸光度和体系在两波长处吸光度

绝对值均下降，表明阴阳离子表面活性剂均能使鸡冠花红与

ＢｓＡ之间结合程度减弱。此结果进一步证明鸡冠花红与ＢｓＡ之间主要靠静电引力作用，ｃＴＭＡＢ及ｓＤｓ参与了鸡冠花红与ＢｓＡ之间的结合反应，削弱丁鸡冠花红与ＢｓＡ之间的静电引力作用。非离了．表面活性剂如Ｔｗｅｅｎ一８０、Ｔ—ｔｏｎ一１（１０对吸光

度影响不大；Ｔ…一２０能抑制鸡冠花红的离解，使空白的最

大吸收波长红移，在５８０ｎｍ处吸光度稍有增加，导致体系在两个波长处的吸光度绝对值略微Ｆ降。

２

３不同蛋白质的工作曲线

在上述选定的测定条件下，分别以Ａ，。，、Ａ，。及△Ａ为纵坐

标绘制了测定各蛋白质的工作曲线．结果发现分别以Ａ铘、Ａ珊及△Ａ为纵坐标时得到的工作曲线的线性范围基本一致，但在５８５

ｎｍ和５２０衄处用单波长光度法测定的摩尔吸光系

数比用双峰双波长光度法采用△Ａ定量的但单波长光度法的摩尔吸光系数要小１—２倍。各蛋白质的双峰双波长法的工作曲线特征参数列于表１中。可见方法具有很宽的线性范围宽，且ｓａｌｌｄｄｌ灵敏度表明该体系对ＢｓＡ、ＨｓＡ及ＩｇＧ具有相近的响应，因此，可用于体液中总蛋白的测定。

表ｌ双嶂双波长法测定各蛋白质的工作曲线

２．４干扰物质的影响

在最佳实验条件下，对多种氨基酸、金属离子、尿素及各种表面活性剂等对５０¨∥ＩＩｌｌＢｓＡ测定的影响进行了试验，结

果见表２。可见当允许相对误差在±５％以内时，大部分共存

物的允许存在量均较高，说明方法具有一定的选择性。

表２共存物对５０旭／ｌｌｌｌＢｓＡ测定的影响

２

５样品分析

将健康人血清样品（云南大学校医院提供）稀释１００倍

后，取一定量稀释后的样品按实验方法和ｃＢＢＧ一２５０方法”分别测定其中总蛋白的含量，井在各稀释后的样品中加入５０—１００¨ｇ的标准人血清蛋白，采用本方法进行了回收率测定，结果见表３。可见，本方法对所有样晶测定的回收率均位丁方法测得的结果基本一致，说明方法测定结果可靠，而与ｃＢ—

ＢＧ一２５０方法相比，该方法简单、快速、稳定性好。

表３样品测定结果

９７％～１００％之间，同时用本方法测得的结果与用ｃＢＢＧ一２５０

３００

中国ＩＪ生椅骑杂志２００６车Ｆ３月第１６卷第３期ｃｈｉｎｅｓｅＪｏｕｍｍ

ｏｆＨｅ舢ｌ

ＬａｂｏｒｍｏＩｙＴｅｃｈｎｏｌｏ盯，Ｍａｒ２００６；Ｖｍｌ６

Ｎｏ３

【化学测定方法】

洋葱多糖及其含量的测定

李茵萍１，昆杜斯 托舍塔森２，孙莲３

（１新疆师范大学生命与环境科学学院，乌鲁木齐８３００５４；

２新疆师范大学教务处，乌鲁木齐８３００５４；３．新疆医科大学药学院，乌鲁木齐８３（）０５４）

［摘要］

目的：对洋葱中的多糖进行提取与测定。方法：采用超声法对洋葱中的多糖进行提取，并采用苯酚一硫酸法…，

测定其多糖的台量。结果：多糖的含量为４３％，平均回收率为９８．５％，脚＝２．５％。结论：结果表明，采用超声波提取洋

葱中的多糖，提取时间短，此方法比用沸水提取的方法简单，快速，灵敏度高。

［关键词］洋葱；超声波；多糖；分光光度法

［中图分类号】０６５７．３

［文献标识码］Ａ

［文章编号］１００４—８６８５（２００６）０３一０３００一０２２实验部分

２．１

洋葱，百合科植物，多年生草本，具有强烈的香气。叉名玉葱、葱头，鳞茎大”Ｊ。随着近年来人们对绿色天然食品的崇

葡萄糖标准溶液的制备

精密称取１０５０ｃ干燥至恒重的葡萄糖标准品２９．４ｍｇ，置

尚，我们对洋葱多糖进行了测定，洋葱是一种在我国广泛种植

的植物．多糖含量丰富。洋葱除含一般营养素外，还含有杀菌

２５０“容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为

Ｏ．１１７６２．２

利尿降脂降压抗癌等生物活性物质：近年来医学临床和研究证明，洋葱具有多种较高的生理药用价值，在营养食疗上被推

祟为多功能的降脂降压抗癌的营养保健食品。我们初次利用

ｍ∥ｌＩｌｌ的标准溶液，闭光保存。

ｌ

５％苯酚试剂的常３备取苯酚１００ｇ，加人０

ｇ铝片和Ｏ．０５

ｇ

Ｎａ２ｃ０】，在

超声波提取洋葱中的水溶性多糖，超声波提取是一种利用外

场介入强化提取过程，具有被浸提的活性物质活性不被破坏，

１７６屯～１７８℃，常压蒸馏，空气冷凝，得白色针状结晶，称取重蒸馏苯酚１２．６ｇ，置２５０ＩＩｌｌ棕色容量瓶中，取水稀释至刻度，摇匀，闭光保存。２．３标准曲线的绘制

精密吸取葡萄糖标准溶液０．２５、０

５、０

７５、１．００、Ｉ．２５

提取时间短，收率高，条件温和等优点：并采用了分光光度法

测定其含量。

ｄ，

１材料与方法１．１仪器与试剂

旋转蒸发仪ＲＥ一５２Ａ型（上海安亭生化仪器厂）；ＫＱ３２００ＤＢ超声波发生器（昆山电子有限责任公司）；７２ｌＥ型分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；真空干燥ＤＺＦ一６∞ｏ

置于２５ＩＩｌｌ的具塞试管中，分别加水至１．５ｍｌ，再分别加人５％苯酚试剂２．ｏｄ，混匀。加浓Ｈ２ｓｏ。６．５ｌＩｌｌ，混匀冷却至室温，置于４０℃水浴中放置３０ｍｉｎ，取出冷却至室温，加水稀释至ｌＯ

ｍ１．混匀。在４９０皿处测定吸光度”。，得回归方程：Ａ

＝Ｏ．０１４５＋６２．６８７Ｃ．ｒ＝Ｏ．９９９８。

（上海一恒）；电子分析天平（瑞士梅特勒）；葡萄糖（ＡＲ，１０５℃

干燥至恒重）；洋葱（市售新疆的晴密白皮，洗净晾干粉碎后过４０目筛）；其他试剂均为分析纯。

２．４洋葱多糖的提取与精制

称取干燥过４０目筛的洋葱粉末１００ｇ，用９５％乙醇回流提取４０ｍｉｎ，除去脂溶性成分和色素等，残渣挥于后于烧杯中加水７００ｍｌ，于９０℃超声提取３０ｍｌｎ，提取３次，过滤后，合

［作者简介］李茵萍（１９７３一），女．寅验师，主要从事有机分析

化学研究。

并滤渡于旋转蒸发仪减压浓缩至２∞耐，加入９５％乙醇至舍醇量为８０％，静置于４℃过夜，倾出上清液，分离，得到粗多

（上接第２９９页）

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［８］Ｂ一向ｒ‘ＩＡ叩ｄ柚ｄ灿ｉｔｉｖｅｍｅ山０ｄ忆ｒ山８ｑＩｌ蚰Ⅱ眦１０ｎ０ｆ皿－

ｃ∞口铋ｑｕａｎ６ｔｌｅｓ０ｆｐｒ“ｋｉｎｕｍｉｚｉｎｇ山ｅｐｄｎｃｉｐＩｅｏｆｐ。Ｄｔｄｎ—ｄｙｅｂｉｎｄｉ“ｇ［Ｊ］ＡｒｌａｌＢｉｏｃｈ锄，１９７６，７２（１—２）：２４８—２５４

（收稿日期：２００５一１１—０５）

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