鸡传染性法氏囊病病毒超强毒上海株SH95基因组B片段的克隆与分子系统进化树分析

第19卷第2期年月病毒学报

Vol.19No.2

June2003

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒上海株SH95基因组

B片段的克隆与分子系统进化树分析

孙建和，陆苹，蒋静，赵渝

（上海交通大学农业与生物学院

生物技术研究所，上海201101）

摘要：分离、纯化了鸡传染性法氏囊病病毒超强毒（VVIBDV）上海株（SH95）的病毒核酸dsRNA，应用随机引物将以此为模板一步扩增出全长基因组B片段，将其克隆入pGEM-T载体，并进行序列分析。RNA反转录成cDNA，

克隆的B片段全长2827个核苷酸，其编码的氨基酸与超强毒株HK46的同源性达98.18%（。分子系统863／879）进化树分析表明，但与基于基因组A片段的系统进化分析完全不SH95超强毒株与美国变异株E的亲缘关系最近，同，表明该毒株在发生过程中基因重配比基因重组发挥了更重要的作用。通过对14株IBDV编码氨基酸序列的分析、比较，推测B片段上11个独特的氨基酸位点可能与毒力相关。关键词：鸡传染性法氏囊病病毒超强毒（；病毒基因组cDNA；全长基因组B片段；序列分析VVIBDV）中图分类号：S852.659.4

文献标识码：A

文章编号：（1000-87212003）02-0138-06

鸡传染性法氏囊病（infectiousbursaldisease，是一种呈现世界性流行的烈性传染病，其病毒IBD）

主要侵害鸡体（infectiousbursaldiseaseVirus，IBDV）的免疫器官，造成免疫抑制，已成为危害养鸡业的主要疫病之一。而近年来，由于超强毒株或变异株的出现，又使本病的发生和流行出现了新的特点，传统的疫苗不能提供足够的保护，更加重了对养鸡业的危害，也给诊断、预防和治疗带来了新的困难。IB-双节段RNA病毒，DV是一种双链、IBDV基因组的A、B两个片段中，A片段含3200!3400个碱基对（，主要包括一个大的连续的开放式阅读框bp）

（ORF），编码分子量约110000，由1012个氨基酸组成的前体融合蛋白，后加工成为成熟的VP2、VP3和VP4。B片段则由2800bp!2900bp组成，主要包括一个连续的ORF，编码一个由878个氨基酸组成的多肽VP1。VP1是病毒RNA依赖的RNA聚合酶，它与病毒RNA的复制有关，含量很少，常以游离多肽或与基因组连接两种形式存在。近年来，人们对IBDV抗原变异和毒力变异的分子机制进行了研究，发现各IBDV毒株之间的基因变异主要集即VP2区域，毒力变中在A片段的大ORF的5/端，异也可能与此有关。迄今，国内外对毒力变异的研究重点都放在A片段上，并初步揭示了可能与毒力

收稿日期：修回日期：2002-04-11；2002-06-28

基金项目：上海市科学技术发展基金资助项目（01JC14034）作者简介：孙建和（，男，江苏海安人，副教授，在读博士，1968-）专业为生物化学与分子生物学。

相关的某些氨基酸位点。虽也有研究表明毒力变异可能受多基因控制，但对B片段进行系统研究则相对较少。此外，为了研究这些变异的分子机制，尽管国内外不少学者都进行了IBDV基因组A、B片段

［1-4］以及VP2-4-3基因的克隆，但他们基本都采用传统的分步扩增，再连接、克隆的策略，并且对国内本土分离的超强毒株的B片段的克隆尚鲜于报道。采用一步法扩增并克隆了IBDV上海超强毒的

基因组B片段，并进行序列分析，为进一步的研究工作奠定了基础。

材料与方法

1毒株IBDV上海超强毒株SH95由上海交通大学农学

［5］院生物技术研究所分离鉴定。2

病毒的繁殖与纯化用105EID50的IBDV上海超强毒株

攻击后3SH95经口服和滴鼻感染4周龄的IBDV非免疫鸡，天，扑杀鸡群，无菌采取鸡法氏囊，匀浆，冻融3次后，进行差速离心和蔗糖密度梯度超速离心，收集含病毒的相应条带，透析，负染，电镜观察，-70C冻存备用。

［，］

3蛋白酶K法提取病毒dsRNA参照孙建和等67的方法进行，获得粗提的dsRNA后，用1.2%的低熔点琼脂糖电泳，

长波紫外灯下割胶分离dsRNA。进一步采用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，获得高纯度的dsRNA。

［，］

CDNA第一链的合成参照孙建和等56的方法进行。

（登5B片段的扩增参照IBDVHK46毒株的基因组序列

录号为G该毒株为一超强毒株），设计、合成了1I：4566482，

4

对引物，引物序列如下：

2期B5：5 B3：5

孙建和等：鸡传染性法氏囊病病毒超强毒上海株 ~95基因组B片段的克隆与分子系统进化树分析 139 3

3

画线部分为限制性内切酶位点。扩增B片段应用ROc1e产品Expand~ig1FidelityPCRsystem进行。模板采用上述的

反应体系为50!RT产物0.5!l，l：1倍的Expand~ig1Fidelity

每种dNTP浓度为0.2mmOl／每种引物浓度为Buffer，L，酶混合物为2.6U，镁离子浓度为1mmOl／300nmOl／L，L。

先在95C变性5m然后进行PCR循环：PCR反应条件为：in，循环30次；循环94C变性30s，55C退火30s，68C延伸240s，

结束后，于68C延伸15m用1.5%的琼脂糖凝胶in。取10!l，（图3）PCR进行了鉴定。基因组B片段的测序结果

表明，该片段长为2827个核苷酸（不包括引物）。因此，认为应用一步法扩增获得的IBDV全长基因组B片段是正确的，所建立的一步法扩增、克隆IB-DV超强毒株B

片段全长基因的方法是可行的。

电泳检测，并应用GIACuickGelExtractiOnKit割胶回收B片段。

B片段的克隆和测序按照产品说明，

将回收的B片段与pGEM-Teasy（PrOmega）载体连接，转化大肠杆菌TG1感受态细胞，涂布于含X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上，C培养过夜，

挑选白色菌落扩大培养，提取质粒，应用PCR做进一步鉴定。样品测序由Takara公司完成。获得B片段序列后，采用DNAtOOls5.1软件进行编辑和分析，并采用GenedOc软件与基因库中相关毒株［超强毒株如：~K46（GI：

）、UK661（GI：1296810）、OKYM（GI：2588911）、D6948（GI：9230681）；强毒株如：~ARNIN-1（GI：）、IL3（GI：5733934）、CU-1（GI：14582983）；弱毒株如：IL4（GI：5733936）、WINTERFIELD2512（GI：）、CEF94（GI：6539896）、T （GI：11139426）；变异株如：VARIANTE（GI：4894792）；"型毒株如：O~（GI：）

］的序列进行同源性和聚类分析、比较。结

果

IBDvdsRNA的分离与纯化

从发病鸡法氏囊中，应用超速离心分离、纯化得

到典型的鸡传染性法氏囊病病毒，应用蛋白酶K消化法提取病毒dsRNA，经琼脂糖凝胶电泳，可获得以约3.2kb和2.8kb为主的两条带，即基因组dsR-NA的A、B两片段。从低熔点琼脂糖凝胶上分别切下A片段和B片段，采用苯酚-氯仿抽提，进行A、

两片段的纯化，

经琼脂糖凝胶电泳，可见清晰的A片段一条带和B片段一条带（图1）。CDNA第一链的合成

应用随机引物，合成cDNA第一链的效率更高。

以此为模板，可扩增出全长基因组A片段和B片

段。IBDvB片段基因的扩增

为获得IBDVB片段的全长基因，应用特异性

引物ORFA5和ORFA3，经94C变性30s，55C退火30s，68C延伸240s，循环30次，结果获得约2p的条带

（图2）。应用T-载体进行克隆，并用图1IBDVRNA的A、B片段

Figure1AandBsegmentsOfIBDVdsRNA

1.Marker；2.Asegment；3.Bsegment

.

图2IBDVB片段基因的扩增结果

Figure2RT-PCROfIBDVBsegment

1.Marker；2.Bsegment.

4

序列分析

通过序列分析与比较发现，其与基因库中某些

毒株的同源性高，其中与美国变异株E的核苷酸同源率达96%，与超强毒株~K96的核苷酸编码氨基酸的同源率为98.18%（863／879）。通过系统发生分析表明，其与美国变异株E在起源上可能较为接近，而与一些超强毒株和弱毒株，无论在氨基酸水平

637456648218042179573393214692911

B2

3

845b

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图!"（&）基因组#片段的*#$%上海超强毒株’()$+,序列及推导的氨基酸序列

-.012!+0*3245.627866260*2679.847*.6:2028*2:4<2849.*:29285#4<"#$%&’()/;//

还是在核苷酸水平上都相距较远（图4、图5）。在该毒株B片段的5/端和3/端，存在高度保守序列（图。VPI基因的终止密码子为TAG，而非有6A、B）

些毒株的CAG。通过对I4株IBDV编码氨基酸

序

图4IBDVSH95基因组B片段上VPI基因氨基酸水平的系统发生树Figure4

PhylogenetictreebasedonthededucedaminoacidsofVPIofIBDVSH

95

图5IBDVSH95基因组B片段上VPI基因核苷酸水平的系统发生树

Figure5

PhylogenetictreebasedonthenucleotideseCuenceencodingVPIofIBDVSH

95

Figure6

图6IBDVSH95全长基因组B片段5/端（A）和3/端（B）非编码区序列

Non-codingregionat5/terminus（A）and3/terminus（B）ofgenomicsegmentBofIBDVSH95

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病毒学报

19卷

列的分析、比较，发现毒力不同的毒株主要在如下位点发生氨基酸规律性变化：（Lys-the）、13位145位（the-a、（a、（asn）146位sp-glu）147位sn-、（g、（a、gly）242位lu-asp）393位sp-glu）511位

（Ser-a、（Pro-Ser）、（Pro-Ser）、rg）546位562位

（Ser-g、（Pro-Ser）等（图7）。646位ly）687位

图7IBDV基因组B片段VP1基因上某些可能与毒力相关的氨基酸位点Figure7

SomekeyVirulence-relatedsitesatgenomicsegmentBofIBDV

氨基酸水平还是在核苷酸水平上都相距较远。但通

讨论

过对该毒株a片段的VP2-4-3基因系统发生的分析和研究，发现它与基于B片段的系统发生树完全不同，它与HK46（香港）、（日本）和UK661OKYM（英国）等超强毒株形成一个较大的分支，同时与国内Harbin-1毒株也存在较近的亲缘关系（图8）。这一结果提示，在超强毒株的发生过程中，遗传重配

［9］比遗传重组发挥着更重要的作用。B片段与美国

最近十年来，在欧洲和亚洲相继分离到鸡传染性法氏囊病毒超强毒株，它的基因组核苷酸序列及由此推测的氨基酸序列均与其它弱毒株存在明显差异。国内在广州、北京和上海也先后分离到了鸡传

［8］染性法氏囊病超强毒株。克隆不同VVIBDV全基

因组并分析其序列，对于了解VVIBDV的致病的分子机制和系统发生十分必要。在应用一步法扩增、克隆VVIBDV全长基因组a片段的同时，又以VVIB-进行B片段全长基因组DV上海毒株SH95为材料，

的扩增、克隆和测序，为进一步研究国内超强毒的分子特征奠定了基础。

尽管目前国内外有一步法扩增、克隆IBDV基因组的报道，但应用一步法扩增、克隆IBDV超强毒国内分离株（上海毒株）的全长基因组B片段尚属首次。该方法的建立为进一步在分子水平上研究病毒基因组功能、抗原变异和毒力变异，研制生物技术疫苗等打下了坚实的基础，也为进行分子流行病学研究提供了可能。

通过对鸡传染性法氏囊病病毒上海超强毒株表明基因SH95全长基因组B片段的克隆与测序，

组全长2827bp，其中VP1基因与超强毒株HK46的编码氨基酸的同源率为98.18%（863／。通879）过系统发生分析表明，它与美国变异株E在起源上可能较为接近，而与一些超强毒株和弱毒株，无论在

变异株E的亲缘关系较近，可能由于该地区长期使用美国进口的疫苗而导致基因重配所致。

图8IBDVSH95基因组a片段上VP2-4-3

基因核苷酸水平的系统发生树Figure8

Phylogenetictreebasedonthenucleotide

seCuenceencodingVP2-4-3ofIBDVSH95