鸡冠透明质酸工业化生产条件优选
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鸡冠透明质酸工业化生产条件优选
472
中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemical
Pharmaceutics201
1年第32卷第6期
鸡冠透明质酸工业化生产条件优选
汪建1,谢镇2,汪清3
(1.贵阳中医学院生化教研室,2.贵州省冶金化工研究所,3.贵州省理化测试分析研究中心,
贵州贵阳550002)
摘要:目的从鸡冠中提取透明质酸。方法绞内机破碎鸡冠。比较打浆与不打浆进行酶解后提取的效果,优化提取条件。结果打浆虽可缩短提取时间,但得率下降,相对分子质量降低。以绞肉机粉碎两次。升高温度至60℃、120目布袋过滤,能较好的除去杂质。提取液使用2倍乙醇沉淀较优。成品透明质酸溶解于水再次酶解,除蛋白质杂质。结论获得了较优的生产条件,成功从鸡冠中提取出透明质酸。
关键词:鸡冠;透明质酸;工业化生产;优选条件中图分类号:TQ464.5
文献标识码:A
文章编号:1005—1678(2011)06-0472-04
Theoptimizationoftheindustrialproductionconditionsofcockscombhyaluranicacid
WANGJianl,XIEZhen2,WANGQin93
(1.Teaching
2.GuizhouInstitute
Department
of
Biochemistry,GuiyangCollege
of
TraditionalChineseMedicine,
of
MetallurgicalandChemicalEngineering,3.GuizhouResearchCenter
andChemical
ofPhysicalTest
Ana砂sis,Guiyang550002,China)
cockscomb.Methods
andResultsIt’Sbetterto
extract
Abstract:PurposeTo
use
a
extract
hyaluranicacidfrom
can
mincertomashcockscomb.Theimpuritiesbeeffectivelyremovedfromthepost.enzyme
via
a
clothingfilterof120muwhenthetemperatureisraisedto60℃.andthesedimentationisbettervia
a
oftwotimesoftheethan01.Hyaluranicacidthengets
puritiesremarkably.Conclusion
secondenzyminginwater
to
decreaseproteinim-
an
Extracthyaluranicacidfromcockscombsuccessfullybythismethod
der
a
betterconditionofproduction.
Keywords:cockscomb;hyaluranicacid;industrialproduction;optimization
以鸡冠为原料工业化生产透明质酸(hyaluronicacid,HA),酶解浸提是HA生产中的关键阶段,对此已有研究报道…。酶解后对提取液分离、纯化,其生产中的影响因素已有分析¨】,本研究在以前报道的基础上做了更深入的探索。1仪器与试药
TJ22一A型绞肉机(广东恒联食品机械有限公司);ML65.F分体立式胶体磨(上海博生水泵制造有限公司);‘p70cm不锈钢抽滤罐。
鸡冠(产地:山东);粗胰酶(胰蛋白酶比活力≥
600
工业级);氢氧化钠和盐酸均为工业级。2方法与结果
2.1
HA生产工艺路线
参考文献[3]。
2.2生产条件选择
2.2.1鸡冠粉碎鸡冠投料100—150kg,经绞肉机粉碎后,一半再次粉碎后酶解浸提(不打浆),另一半用胶体磨打浆后酶解浸提(打浆),对两组在酶解提取时间和效果的影响上作了比较研究,结果见
图I。
u/g、胰淀粉酶比活力≥7
000
000
u/g、胰脂肪酶比
由图l可见,两组提取液在酶促反应前期,鸡冠中HA逐渐溶解和释放,溶液黏度不断升高。水解一段时间后,鸡冠中HA大部分溶解入水中,曲线上升到顶点并出现短暂平台,之后HA自身降解成为主要矛盾,提取液黏度转为下降,提示酶解已进行完
内容需要下载文档才能查看毕。两组成品HA检测数据见表l。
活力t>4
u/g,产地:湖南);硅藻土(60—180目,
收稿日期:2010-08-25
作者简介:汪建,男,副教授.从事生化药物提取及中试生产放大研究,Tel:0851-5616294,E-mail:jshuims@qq.corn。
中国生化药物杂志ChineseJournal
ofBiochemicalPharmaceutics
2011年第32卷第6期473
5
4:
保证HA生产质量及收率的重要前提。经反复对比研究,发现HA在提取液中的溶解量及相对分子质量(M,),与提取液黏度大小呈正相关变化。在生产实践中,采用测定提取液黏度作为提取效果及终止反应的指标…,对保证HA质量十分有效;经一段时
fm
鑫3
蕾
21
间实际操作后,又简化为直接读取“乌氏黏度计”中提取液流速时间作为变量指标,省去了换算成黏度
not
一▲一.打浆;一×一,不打浆
一▲一.Cockscombisbroken:一x一.Cockscombin
broken
的麻烦,使生产中的质量监控变得非常快速、简单而易操作。
2.2.3提取过程中搅拌强度的选择在HA提取过程中需要不断加热以保持45℃恒温,如果不搅
图1
Fig.1viscosity
打浆与不打浆对HA提取时间和黏度变化的影响
Effect
on
HAin
timeofitsextractionandchange
or
ofits
parti
whethercockscombismadeintopulpofmeat
clesofmeat
表1
Tab.1
ofgroups
打浆组与不打浆组各种参数变化的比较
拌,会带来控温困难、局部过热而影响HA的提取。但是,搅拌又产生强大剪切力,破坏HA的jI,,。经研究,找到了较好的搅拌条件,见表2。搅拌强度过大,对HA造成破坏,提取液黏度下降明显,不宜用于生产。选择双叶平桨、搅拌速度60r/min,提取效率高,生产时间短,对黏度影响小,适用于生产。
Comparisonbetweenthechangesofvariousparameterswhethercockscombisbroken
or
not
打浆组提取高峰出现在6—7h,比不打浆组高峰出现时间缩短3h。但打浆过程同时破坏了HA,使成品中大分子HA减少,小分子HA增多,并不易被两倍乙醇沉淀下来,导致收率下降、黏度下降。鉴于打浆对HA的破坏,在HA的提取中,选择用绞肉机进行两次粉碎,然后再提取的方法更优。2.2.2酶解提取HA中监控指标的确定
在提取
HA的工艺中,寻找简便易操作的质量监控指标,是
表2
Tab.2
2.2.4
酶解液过滤条件酶解液内含有鸡毛、未溶
解的鸡冠和杂质,由于提取液黏度极大,给过滤带来困难;使用孔径大的滤布过滤,在真空抽滤下仍无法进行。分析发现,高黏度的滤液象粥样斑块一样,敷在滤布上堵塞滤孔;加硅藻土助滤,仍发生粥样斑块敷在硅藻土上,无法过滤。经反复试验,确立了提高滤液温度的方法解决这一难题,而且可以用120目的滤布加硅藻土助滤快速过滤。见表3。
+{7
不同搅拌条件对提取液黏度的影响
underdifferentconditionsofagitation
Effect
on
viscosityofextraction
表3
Tab.3
Effect
on
120目滤布抽滤下不同温度对过滤的影响
at
filtrationdifferenttemperaturesvia
a
clothingfilterof120mu
在生产实践中,分离杂质的时间不能拖得太长,否则会带来HA降解、黏度下降、甚至细菌生长产生腐败的情况。55℃时,鸡冠投料150kg可得提取液
400
使用。所以,在生产中选择60℃作为过滤温度比较恰当,由于过滤较快,对HA降解的影响不大;滤液在过滤时温度自然下降,但仍保持在抑菌的45℃范围…;温度降低,黏度回升到7.7左右。助滤介质硅藻土,180目以上时易堵塞,60—180目较为理想;滤布的选择,目数小的过滤效果不好,目数大的过滤
内容需要下载文档才能查看速度太慢,失去生产意义,而120目比较适中。
kg,用直径70cm的真空抽滤罐全部过滤完需
要20h以上,并且lh需要更换滤布1次,提取液损
失很大、还容易因滤液温度降低而孳生细菌导致腐败。65℃过滤虽快,对HA降解的影响也大,不宜
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中国生化药物杂志Chinese
JournalofBiochemicalPharmaceutics201
1年第32卷第6期
2.2.5不同乙醇用量沉淀HA对蛋白质含量的影响HA提取液经反复除杂质及过滤,得到澄明溶液,再用95%乙醇沉淀得HA成品。选用不同比例
高。分析原因,鸡冠中的蛋白质经酶水解,生成了大小不等的肽链和氨基酸,在2倍乙醇沉淀时,大分子肽链与HA一道沉淀了,短肽、寡肽及降解的小分子
的乙醇进行沉淀,对HA产品中的蛋白质含量有显HA却留在了上清液中。如果用3.5倍乙醇沉淀时著影响。本研究选用2个不同批次的提取液,每批次再分为A、B两组,分别用2.0倍和3.5倍95%乙
(低于3.5倍沉淀不完全,大于3.5倍沉淀不增加),所有的HA和大小肽链一起沉淀下来,使产品
醇进行沉淀,分析不同乙醇用量对HA质量的影响,HA的收率升高,但蛋白质等杂质含量也明显升高,结果见表4。从表4可见,2倍乙醇沉淀对HA收率虽低于3.5倍乙醇沉淀物,其蛋白质的含量也明显降低,而产品膨,却显著升高,葡糖醛酸含量也较
Tab.4
Effect
on
contents
从葡糖醛酸含量明显降低来看,HA的纯度受到了影响。因此,在以后的生产中,均采用2倍乙醇沉淀法生产HA,取得了满意效果。.
ethanolofdifferentdensitiesisprecipitated
表4不同乙醇浓度沉淀对HA中蛋白质含量的影响
protein
when
提麟分组95%言譬溅H?≥率丽高篆鼍‰面以
1组B2组A
3.5倍0.7332.0倍0.656
17.59.3
17.39.5
5.87×105
6.34×105
葡臀酸
17.122.5
1塑曼i:!堡Q:!竺
本工艺
!!:兰!!:!』:2Q兰!Q:!!:1
2.2.6二次酶解对HA纯度及肘,的影响次品,对次品的再处理也是必须研究的课题。为此,本研究选取了4组有代表性的产品(蛋白质含量分别代表:24%,10%一15%,5%一10%,<5%),进行了再次酶解除蛋白,工艺流程见图2。二次酶解纯化结果如表5。可见,二次酶解除蛋白的效果明显,4批次蛋白质均降至4%以下,但HA的』lf,也下降;糖醛酸的含量明显提高,说明HA得到了纯化。
沉淀物
对HA质量的控制是比较稳定的,特别是蛋白质含量可控制在5%一15%。对连续生产的60批产品作了一个分类,其中蛋白质含量<5%的占27%,5%一10%的占25%,10%一15%的占48%。仅有一批次产品的蛋白质含量过高,达到了24%(企业
定为不合格品)。在生物制品的生产中,难免出现
HA
鱼坚j堕坚消化液』生墅墅塑堕兰粗滤液』型堡望苎圭堂§澄明溶液』望堕蔓
产品HA
图2二次酶解除蛋白的简单流程图
Fig.2
洗涤、脱水、于燥
无菌操作
Simplechartofprocedureofsecondenzymesinrelievingprotein
表5不同蛋白质含量的HA二次酶解结果
Tab.5
ResultswhenHAissecondlyenzymedindifferent
contents
ofProtein
3讨论
工业化生产HA的工序中,各种条件的控制都应以尽量减少HA的降解为前提,同时还要兼顾除蛋白质的效果。在生产实践中体会到,鸡冠过度粉碎(打浆)、酶解时间过长或二次酶解,虽然可以明显降低蛋白质含量,但HA的降解也增大。
在布袋过滤前,提取液温度从45℃升至60℃,应快速完成(本生产用时大约10rain),达温后立即过滤,以尽量减少高温持续时间,减低对HA降解的影响。
小分子HA在2倍乙醇浓度下不易被沉淀,加
内容需要下载文档才能查看大乙醇用量可提高HA的收率,但产品中蛋白质含
中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2011年第32卷第6期475
量也增高,还增加了乙醇回收的工作量,增大生产成本,不宜使用。
使用超滤器虽然能起到纯化HA的作用,但大规模生产中不能承担处理量而不实用,因为在生产中增加工作环节,就会增加生产时间、增加污染、增加腐败,尤其是从气温较高的晚春到晚秋,一年中的大部分生产时间,稍不注意就会导致提取液腐败,出现次品。
当产品蛋白质含量>15%时,二次酶解效果较优,而非酶解的其他方法纯化效果不好。如果蛋白
质含量<15%,不宜使用强烈的酶解方法,用十二烷基硫酸钠(SDS)来纯化,可使蛋白质含量降至0.5%以下,获得较高纯度的HA。参考文献:
[1]
汪建.汪清,谢镶.酶解条件控制对透明质酸工业化提取的影响[J].中国医药工业杂志,2010,41(1):20-23.[2]
谢镇,汪建。汪清.鸡冠透明质酸工业化生产中质量影响因素分析[J].中国生化药物杂志,1993。(4):19-22.[3]
汪建,谢镇。汪
清.鸡冠透明质酸的工业化生产[J].中
国生化药物杂志,1993,(4):16.18.
山楂总黄酮抗心肌缺血作用及机制
周玲,邓琳,赵浞
(华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院,湖北武汉430014)
摘要:目的研究山楂总黄酮抗心肌缺血作用。方法受试动物分为正常对照组、模型组、阳性药组(复方丹参注射液)、山楂总黄酮(低、中和高)三个剂量组,分别采用垂体后叶致小鼠心肌缺血模型和大鼠冠状动脉结扎致
心肌缺血模型。各组动物连续腹腔注射给药5d后造模,测定小鼠血清中LDH、CK、SOD的活力和大鼠相关心功能
指标。结果山楂总黄酮能明显改善血清酶学指标和心功能指标。结论山楂总黄酮对预防心肌缺血有较好作用,其机制可能与抑制心肌自由基生成有关。
关键词:山楂总黄酮;心肌缺血;心功能
中图分类号:R285文献标识码:A
文章编号:1005-1678(2011)06拼75-03
on
Theprotectiveeffectofhawthornflavonoids
myocardialischemiaanditsmechanism
ZHOULing,DENGLin,ZHAOShi
(WuhanCentralHospitalAffiliated
to%,倒Medical
School
ofHuazhong
Science
andTechnologyUniversity,Wuhan430014,China)
Abstract:PurposeToobservetheeffectofhawthornflavonoidsagainstmyocardialischemia.Meth-
odsRatsandmicewererandomlydividedintonormalcontrolgroup,positivecontrolgroup,modelgroup
andthegroupofhawthornflavonoids.Pituitrin
rats
was
used
to
inducemicemyocardialischemiamodeland
coronaryartery
ligationmyocardialischemiamodel.Fivedaysafteradministrationofthedrugs,the
activityofsuperoxide
can
levelsoflactate
dehydrogenase(LDH),cmatinekinase(CK),the
ratswere
dismutase(SOD)
andcardiacfunctionofmeasured.ResultsHawthornflavonoids
significantlyimproveserum
a
enzymologyindexesandcardiacfunctionofrats.ConclusionHawthornflavonoidshave
on
protectiveeffect
to
acute
myocardialischemia,andtheprotectivemechanismsofhawthornflavonoidsmayberelated
in
hibitingmyocardialfreeradicalgeneration.
Keywords:hawthornflavonoids;myocardialischemia;cardiacfunction
缺血性心脏病是指冠状动脉功能性或器质性病
收稿13期:2011-05-09
作者简介:周玲,女,副主任医师。Tel:027-82211469。
变导致的血液灌注减少,心脏供氧减少,心肌能量代
内容需要下载文档才能查看谢异常,不能支持心脏正常工作的一种病理状态。
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