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鸡卵黄免疫球蛋白的分离制备研究

上传者:林仁刚
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上传时间:2015-04-21
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鸡卵黄免疫球蛋白的分离制备研究

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鸡卵黄免疫球蛋白的分离制备研究

宋宏新梁 艳

(陕西科技大学生命科学与工程学院

实验研究了从高免鸡卵黄中分离纯化免疫球蛋白(IgY)的方法18

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盐析

总活性回收率达到64.16%

卵黄免疫球蛋白

超滤法

添加3%硅藻土进行微滤

结果表明

卵黄十倍稀释

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再用45%饱和硫酸铵(pH5.3)

LIU XuanLIANG Yan

(College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology,

Xianyang      712081, China)

Abstract 

2004-04-26

基金项目

宋宏新(1959-)

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教授

1999, 50: 308-310.[9]宁正祥, 高建华. 食品防腐剂的抗菌机理及构效关系[J].

广州食品工业科技, 1997, 13(3): 1-4.

[10]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quanti-

ties of protein unilizing the principle of protein dye binding[J]. Anal Biochem, 1976, 72(1): 248-252.

[11]Motohiro T. Protamine and emusifiers as food preservative

[M]. Kokai Tokky Koho, 1987. 25, 62, 926.[12]Akazawa H, Yajima M. Food preservatives containing

protamine mixture[M]. Jp Kokai Tokkyo Koho, 1988. 17,63, 976.

[13]Akazawa H, Yajima M. Protamine-containing compositions

as food preservatives[J]. Jpn Kokai Tokkyo koho, 1988. 62,201, 563.[14]何华. 国外新开发的几种天然食品防腐剂[J]. 四川食品工

业科技, 1995, (3): 21-22.[15]Aspedon A, Groisman E A. The antibacterial action of

protamine: evidence for the disruption of cytoplasmic mem-brane encrgization in Salmonella typimurium[J].Microbiology, 1996, 142: 3389-3397.

. Milt protein[J]. Annual Report of the

Tokyo Metropolitan Research Laboratory of Public Health,

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18. The thawed yolk solution was added with 3% diatomaceous earth, and filtered through 0.

45

IgYultrafiltration

TQ93                               文献标识码

随着免疫学和生物化学检测技术的迅速发展鸡卵

黄可富集从鸡血清中转移而来的大量特异多克隆抗体IgY

因此

寻找一种简便

经济的方法

1材料与方法1.1

试剂与材料

混合纤维素酯微孔滤膜    孔径0.45上海兴

亚净化材料厂

Millipore公司SDS-PAGE成套电

泳试剂1.2

新鲜免疫鸡蛋

120日龄新开产母鸡

用法氏囊

病毒(IBDV)作抗原

集效价达1:64以上的鸡蛋为原料

调节pH

解冻             微滤                            超滤

卵黄原液

添加适量硅藻土

盐析                       PBS溶解

脱盐

DEAE-Sepharose F.F.离子交换层析

(1)在水稀释和微滤这两步实验中

6.0)0.1mol/L)稀释倍数(1:4

1:

11)5%)及冻融效果

图1   鸡卵黄抗体分离纯化流程图

Fig.1 Flowsheet of IgY isolation and purification

1.4IgY分离纯化工艺中的检测

IgY存在于卵黄水溶性组分(Water-Solution Fraction,WSF)中说明IgY提取保留率越高说明杂质去除越彻底

以这两个指标作为制定工艺优劣的主要依据

1002-6630(2005)04-0051-04

甲醇提取法[3]

双扩及酶

联免疫吸附实验(ELISA)进行检测

3%浓

缩胶1.4.4微滤速度的测定

微滤速度   单位时间通过微滤膜的液体体积(ml/

min)2结果与分析

2.1

卵黄水溶性组分(WSF)的制备与分离[5,6]

鸡卵黄乳状液是由卵黄蛋白水溶液(连续相)和分散于其中的脂蛋白小颗粒(分散相)组成的

IgY存在于卵黄蛋白水溶液中分离纯化的关键便是如何有效除去卵黄中高含量的脂类以制备卵黄水溶性组分(WSF)

2.1.1

稀释倍数的影响分别取20ml卵黄液

搅拌均匀

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18

解冻

可以看出

蛋白质含量逐

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lm/gm(量脂肪含蛋白质含量(mg/ml)

稀释倍数

图2   稀释倍数对WSF中蛋白质含量和脂肪含量的影响

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Fig.2 Effect of dilution times on the contents of proteins

and lipids in WSF

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ÔÚÏ¡Êͱ¶Êý´ï1:9ºó΢ÂËЧ¹ûÒ²±íÃ÷

¿¼Âǵ½ºóÐøµÄ

·ÖÀë´¿»¯²Ù×÷2.1.2

pHÖµµÄÓ°Ïì·Ö±ðÈ¡20mlÂÑ»ÆÒºÓÃ

HClµ÷½Ú²»Í¬pH

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18

½â¶³

ÓÉͼ¿ÉÒÔ¿´³ö

5.5)

¶øÖ¬µ°°×³Á½µÁ¿½Ï´ó

Ö¬·¾º¬Á¿×îµÍ

ͬʱ

¾-µçÓ¾·ÖÎö2.1.3

ÑÎŨ¶ÈµÄÓ°Ïì

·Ö±ðÈ¡20mlÂÑ»ÆÒºµ÷

½ÚpHΪ5.3

ÏÂÀ䶳ºó

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4

½á¹ûÈçͼ6ºÍͼ7Ëùʾ

ÔÚµÍÑÎŨ¶ÈÏÂ

È¥Ö¬

Ч¹û½ÏºÃ

Ëæ×ÅÑÎÀë×ÓŨ¶ÈµÄÉý

¸ß΢ÂËËÙ¶ÈÒ²ÏÔÖøϽµ

2.1.4

¶³ÈÚ¶Ô΢ÂËËٶȵÄÓ°Ïì·Ö±ðÈ¡20mlÂÑ»ÆÒºµ÷

½ÚpHΪ5.3

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18

½â¶³)µÄÂÑ»ÆÏ¡ÊÍÒº½øÐÐÁ˱ȽÏ

表1 不同处理方法对微滤速度的影响

Table 1 Effect of different processing methods on Microfiltration

rate

´¦Àí·½·¨Æ½¾ù΢ÂËËÙ¶È(ml/min)

²»¾-À䶳0.31½øÐÐÀ䶳Ԥ´¦Àí

5.90

从表中数据可以看出

微滤速度提高了约19倍对稀

释卵黄液进行冻融预处理可以大大改善分离效果

直接过滤的后

果是在过滤初期膜就会被各种粘稠的脂肪和脂蛋白所堵

实验条件同2.1.4的冻融预处理实验

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搅拌均匀后用0.45结果如图8所示

水以1:9进行稀释冻6h

自然解冻

最终总活性回收

率达到64.16%

用膜微滤技术取代了传统

的高速冷冻离心方式

过滤速度(采用微滤

速度单位为ml/cm2现工业化生产剂

活性回收率

更有望能实没有使用有机溶这样可以提高IgY的

成本较低

所以下冷

随着硅藻土用量的加大

在加量达3%后

尽可能的减少蛋白质被硅藻土吸附的损失2.22.2.1

IgY的浓缩分离与纯化

考虑

超滤浓缩[7]与盐析分离[4]IgY收集微滤透过液采用室温下进料超滤膜分子截留量为5万105Pa)

105Pa)

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再经高速冷冻离心(10000

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沉淀

选择pH7.0的Tris-

HCl缓冲液(THB)进行梯度洗脱

经DEAE-Sepharose F.F.柱层析分离纯化后

结果表明

30min)后得到IgY

33.1

结  论

通过实验确定的用水稀释法和微孔过滤法制备和分

卵黄液用蒸馏

离卵黄水溶性组分(WSF)的最佳条件为

日本新推出低聚糖型比非斯特健美功能饮料

比非斯特健美饮料是日本新推出的低聚糖型功能饮料另外添加了食用纤维

由于双歧杆菌增殖能合成更多的B族维生素

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以常饮用该饮料可助皮肤白嫩滋润

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