果酒酵母的分离、纯化及选育(实验报告定稿)

一、引言

酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为 7×12μm，含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。优良纯种酵母应具备下列性能：（1）除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香。（2）生长速度快，有较高的发酵能力，能将糖分全部发酵完。（3）具有较高的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。（4）培养基成分简单，来源广泛，价格低廉，对温度，pH，离子强度，溶氧等环境因素不敏感。（5）能在低温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。

由此可见， 酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。要获得优良的酿酒酵母，必须对其进行分离选育。果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中采样分离，如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。根据实践经验，在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高，因为它们的基质环境与酿酒环境很相似。为使我们需要的酵母易于检出，应对采集的样品进行富集培养，通过设置较高的酒精浓度、添加SO2 、调整pH 等手段抑制不需要的微生物的生长，使希望检出的微生物得到增殖 。酵母检出后，应对其的发酵性能进行考察，包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等，这些可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。

二、实验仪器与材料

样品：新鲜苹果（未经清洗）榨汁。

YEPD 培养基（富集培养基）: 蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母膏10g，蒸馏水定容至1000ml. （每次根据需要量按如此比例配置，下同）

PDA培养基（酿酒酵母培养基） ：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml.（马铃薯去皮，切成块煮沸后再煮30分钟，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂溶化后定容至1000 ml。121℃灭菌30分钟。）

PYG培养基（菌种保藏培养基）：蛋白胨3.5g，葡萄糖15g，酵母膏1.5g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O1.0 g，（NH4）2 SO41.0 g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml.试剂：亚硫酸钠、乙醇，碘液，无菌生理盐水等。

器具：三角烧瓶(250 mL)、无菌试管、无菌吸管(1 mL及5 mL)、无菌滴管、接种环、冰箱、酒精喷灯、冰箱、玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。

三、实验方法与步骤

酵母菌在自然界中存在的范围非常广泛，可以从不同的陆地或海洋生物环境中分离得到。在成熟水果的果皮、果梗上存在的酵母种类十分丰富，可针对不同水果原料分离出适合其自身特点的酿酒用酵母菌。

1

1．酵母菌的分离初筛

1）菌种采样

土壤

样品 瓜根际土藤下方土垄间隙土叶片

壤 壤 壤

用无

剪刀

取不用无菌小铲清去表层石块露出土壤采集 生长后，戴好无菌手套取500g左右的土方法 段的样装入无菌袋内。 片装

无菌

内。 果实（带柄） 腐果 菌剪同阶叶入袋用无菌剪刀摘取不同龄期的甜瓜（幼龄期，膨大期，成熟期）分别装入无菌袋内。 用无菌剪刀摘取腐烂的果实装入无菌袋内。

随机选择三块样地采样，每样采三份，将采集到的样品迅速保存在低温箱内(冰块降温)。

2）富集培养与纯种分离

方法：配制YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然后分别取适量样品（土样1g，果皮5g ，果柄若干，叶片若干）各三份接种，120r/min，28℃摇床培养4天。将富集培养液用接种环划线接种在PDA培养基上，每个样品接三个平板，28℃恒温培养。待菌种长出小菌落，镜检为酵母菌后，将其挑取于PDA平板划线并标号后28℃恒温培养。待再次长出单菌落后，挑取划线于PDA培养基上，28℃恒温培养。菌种划线三到四次后基本纯化。

2．酵母菌种的复筛

以无琼脂PDA培养液作为复筛培养基。将初选菌种接入保藏培养基。培养24 h后每支斜面接入三角瓶培养，置于23-25 ℃的培养箱中培养，测定其发酵水平及产香水平，选育出优良健壮、耐性强的适合果酒发酵的酵母菌种。

发酵力试验：采用CO2失重法，取100 mL 三角瓶(已经烘干、称重)，各加入80 mL无琼脂PDA培养液，置于80℃的水浴杀菌5min，冷却到30℃后，按每升接种30 mL的比例分别接入酵母种子液，在20 ℃下发酵。发酵过程中每24h 测定1次CO2 损失量，每次测定时，摇晃瓶子，以排出CO2。随着发酵时间的延续，瓶重逐渐减轻， 直到减轻量不高于0.2 g，即表示发酵结束，以CO2失重量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制发酵力曲线，并确定菌株发酵力的强弱。

3．酵母菌的耐受性试验

采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（4%、6%、8% ）、二氧化硫（20、40、60 mg/L）的耐性。将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的果汁培养基中，在相同条件下培养，观察杜氏管中气泡产生情况，重复3

2

次。

活化条件：28 ℃条件下，将纯种分离的菌种接种在PDA培养基培养48h 发酵条件：28℃条件下，水果原汁培养基中静止发酵4 d；

接种量：1×107 cfu/mL（各菌种浓度在同一数量级即可）。

1）耐酒精度试验

按下表在试管中加入培养液。然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115℃ 20min灭菌。灭菌完后，待试管温度为常温后按下表加入酒精，加完后摇匀。最后在每个编号试管中接入对数期酵母1×107个，28℃静止培养。观察产气情况，选出耐酒度比较好的菌种。

将标签贴于各试管上，标4、6、8，按下表每管加入各量：

试管编号 0 1# 2# 3#

95%酒精/mL 0 0.42 0.63 0.84

果汁/mL 10 9.58 9.37 9.16

培养液含酒精%0 4 6 8 （v/v）

2） 耐SO2试验

按亚硫酸含量为6% 计， 计算出20、40、60 mg/L浓度所需的量，分别加入到培养液中制成SO 2 不同浓度系列的液体培养基。

按下表加入培养液，然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115℃ 20min灭菌。灭菌完后，待试管温度常温后按上表加亚硫酸（科密欧试剂SO2含量≥6%），加完后摇匀。最后在每发酵管中接入对数期酵母1×107个，28℃静止培养。观察产气情况，选出耐SO 2比较好的菌种。

将标签贴于各试管上，标1、2、3、4、5，按下表每管加入果汁量： 试管编号

亚硫酸/uL

果汁/mL

培养液含SO2mg/L

四、实验结果

1）发酵力测定 0 0 10 0 1 3.3 10 20 2 6.7 10 40 3 10 10 60

3

2）耐酒精度性质测定

乙醇浓度（%）

4

产气时间（d）

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 2 4

A菌 - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - + - - - - -

4

B菌 - + + + - - - - - + + + - - - - - - - - + + + ++ - -

C菌 - - - - - -

- - + ++ ++ + - - - - - - - - - - - + - -

6

8

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 - - - - + - - - + - - - - - - - - + + + - - - - - - - - - -

3）耐SO2浓度测定

SO2浓度（mg/L） 产气时间（h） A菌

20

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 6 8 10 12 14 16 18

- + + + + + ++ ++ ++ ++

B菌

- + ++ +++ +++ +++ ++ + + +

C菌

- - - + ++ +++ ++ + + +

40

60

- + + - + - + + ++ + - + + - ++ + -

5

- - + ++ ++ +++ ++ + + - - - + ++ +++ ++ ++ - - - + + ++ ++ + + - - - + ++ ++ + ++