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啤酒酵母蔗糖酶的提取、纯化及测定研究

上传者:沙嘉祥
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上传时间:2015-05-08
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啤酒酵母蔗糖酶的提取、纯化及测定研究

浙江工业大学海洋学院

生物化学实验论文

专业:食 品 科 学 与 工程

班级:食 品1201

姓名:徐 素 媛

啤酒酵母蔗糖酶的提纯及相关性质测定研究

作者:徐素媛 单位:浙江工业大学海洋学院食工1201班

摘要:为了了解酶的提取及及初提纯方法,并在此基础上掌握Q Sepharose-柱层析法提纯酶、DNS法测定酶活力、Folin-酚法和微量凯式定氮法测定蛋白含量以及SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理和方法,需要进行一系列的实验,主要实验过程如下:啤酒酵母自溶后经多次分别离心得到初提液A、热提取液B和乙醇提取液C。利用Q Sepharose-柱层析法洗脱乙醇提取液C得到洗脱液,通过测定洗脱液的吸光值及酶活力的定性测定,选取活力最高的洗脱液得到柱分离液D。接着进行定量酶活力测定,根据葡萄糖标准曲线的方程计算4个样品的总活力单位数和酶回收率,并得出随着蔗糖酶的不断提纯,酶的总活力单位数和酶回收率都逐渐减小。随后用Folin-酚试剂法测样品中蛋白质的含量,与用微量凯氏定氮法测定的结果进行比较,后者测出的总蛋白含量比前者大,并得出A、B、

C、D4个样品的比活力在一步步的纯化中逐渐升高,纯化倍数也明显增大,而总酶活、总蛋白和蛋白回收率却在下降。最后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法通过凝胶对样品的筛选分离、染色、洗脱等步骤测量蛋白质分子和染料的迁移距离来间接测定蔗糖酶的相对分子质量。

关键词:蔗糖酶 提纯 酶活力 Folin-酚法 微量凯式定氮法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

正文:

1、文献综述

1.1 总述

啤酒酵母也叫营养酵母,为酵母科、酿酒酵母属,可作食用、药用和饲料酵母,还可以从其中提取核酸、谷胱甘肽、蔗糖酶、细胞色素c等营养物质[1]从啤酒酵母中提取蔗糖酶的一般工艺过程包括提取和分离纯化以及相关性质测定[2]。

1.2 蔗糖酶的提取

蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase),可作用于β-1,2糖苷键,并将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。按水解蔗糖的方式,蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶(β-D-frutofuranosidases, EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶(α-D-glucosidases, EC3.2.1.20)。前者存在于酵母中,后者存在于霉菌中。工业上多从酵母中提取[3]。酵母蔗糖酶的提取可采用酵母自溶法、冻融法和SDS抽提法,用不同提取方法所得蔗糖酶的活性不同,实验研究表明,SDS抽提法的酶活性最高,冻融法次之,常规的甲苯自溶法酶活性

最低。SDS抽提法提取效率最高最高,还具有操作简便易行、生产成本低、回收率高等特点,更适合酵母蔗糖酶的工业化大规模生产[4]。

1.2 蔗糖酶的纯化

1.2.1 初步纯化

蔗糖酶的初步纯化一般采用热提取法、乙醇沉淀提取法,并在此过程中应用离心的方法,得到蔗糖酶的初提取液。

1.2.2 离子交换层析法

离子交换层析是分离蛋白质应用最广泛的技术,蛋白质的两性特征意味着它们可

以依pH值不同而呈阳离子或阴离子状态存在。其等电点决定了所用介质的pH值及所选离子交换剂的类型。蔗糖酶的等电点在酸性,在pH=7.3条件下选择阴离子交换剂。蛋白质与离子交换剂之间结合的强度取决于蛋白质上共同发挥作 用的离子基团数目、离子交换剂上电荷的密度以及流动相的离子强度。因此,蛋白质的洗脱可用离子强度递增的梯度方式进行,也可用pH梯度方式进行。由于 pH的变化可能导致酶的失活,故一般用离子强度递增的方法来纯化酶。提高分离效果的实验条件选择可以从以下三方面考虑:(1)离子交换剂类型的选择;

(2)洗脱液pH选择;(3)洗脱液的离子强度的选择。通过实验,比较DEAE-纤维素层析法、DEAE Sepharose层析法和Q Sepharose层析法,得出采用DEAE-纤维素层析法的结果是穿透峰大,且穿透峰的酶活很大,说明纤维素吸附蔗糖酶的量很少,即介质载量低,柱容量低,导致回收率低。由于穿透峰大,得到的洗脱峰很小,且酶活也很低,有时测得的酶活峰不在蛋白峰上,达不到实验效果,通过比较最终得出Q Sepharose层析法的效果最好,其具有如下特点:(1)提高实验效果。琼脂糖凝胶离子交换介质比纤维素介质载量高,分离纯化蔗糖酶穿透峰小,分辨率高,回收率高,蔗糖酶与杂蛋白得到了很好的分离,提高纯度,真正体现离子交换色谱蛋白质纯化上的优越性。(2)缩短实验时间。梯度洗脱时间大大减少。(3)节约实验支出。离子交换介质DEAE-纤维素由于流速慢,柱床高度会随缓冲液浓度及pH改变,不能承受0.1M以上NaOH清洗,重生效果差,寿命短。琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性,且其化学稳定性极高,不易破碎,可以承受1MNaOH的清洗,重生效果好,可以使用数百至上千次,因而降低了成本[5]。

1.3 酶活力测定法

测定酶活力的方法多种多样,包括还原法、色原底物法、粘度法、HPLC法(高压液相色谱法)、免疫学方法,其中还原法是指酶与底物在特定的条件(温度、 值、底物浓度等)下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。目前常用的还原法有:DNS法、砷钼酸盐法、酚硫酸法和地衣酚法。这些方法各有特点,应用的范围也不尽相同。DNS法和砷钼酸盐法主要用于木聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶的活力测定,砷钼酸盐法较DNS法更为适合微量测定;酚硫酸法测定的是全糖而非还原性的糖,因此该法不适于测定NSP酶类;地衣酚法用于测定戊糖,虽然灵敏性好,但因试剂昂贵等原因较少应用[6]。本实验采用的是DNS法。

1.4 蛋白质浓度测定

蛋白质含量测定的方法有考马斯亮蓝法、紫外分光光度法、Folin-酚法及双缩脲试剂法,本实验采用Folin-酚法,Folin-酚法又称Lowry法,首先在碱性溶液中形成铜-蛋白质复合物,然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂,产生深蓝色的钼蓝和钨蓝复合物,这种深蓝色的复合物在750nm和660nm处有最大的吸收峰,颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比,可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的浓度[7]。

1.5 蛋白质分子量测定

蛋白质分子量的测定方法有多种,如渗透压法、光散射法、超速离心法、凝胶色谱法及聚丙烯酰胺凝胶电泳法等,目前在实验室中应用较多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳法,另外近年来发展较快的质谱技术也可测定生物大分子物质的质量,其灵

敏度和准确度为各种方法之首,电喷雾质谱法是目前测定蛋白质分子质量最准确地方法之一,其系统误差非常小,但质谱仪价格昂贵,不宜做常规分析手段[8]。

2、实验研究过程

2.1 蔗糖酶的提取及初提纯

2.1.1实验原理

酵母中含有蔗糖酶,而蔗糖酶属于胞内酶,所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法,本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。酵母经自溶破碎细胞壁后,经菌体分离提取蔗糖酶液,再经热提取、乙醇沉淀提取,使蔗糖酶得到初步的提纯。

2.1.2材料与方法

2.1.2.1材料

2.1.2.1.1试剂

①新鲜的啤酒酵母;

②醋酸钠(AR);

③甲苯(AR);

④4mol/L醋酸;

⑤95%乙醇(<-20℃);

⑥0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。称取121.1g Tris溶于1500ml的蒸馏水中,用4 mol/L HCl调节pH至7.3(HCl量约为230ml),用蒸馏水稀释到2L,即为0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。

⑦0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液:将0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液稀释10倍即得。

注:整个实验要注意避免高温,以防止酶失活。

2.1.2.1.2器材

①锥形瓶250ml(×1),50ml(×1);

②量筒10ml(×1),25ml(×1);

③烧杯100 ml(×1),1000 ml(×1);

④具塞试管10 ml(×3);

⑤吸球、玻棒、滴管、pH试纸;

⑥培养箱;

⑦恒温水浴箱;

⑧磁力搅拌器或梯度混合器,搅拌子;

⑨高速冷冻离心机。

2.1.2.2 实验方法

①细胞破碎的方法:化学裂解法

②离心分离法

③热提取液B:等电沉淀法

2.1.3 操作过程

1、酵母的自溶

2、初提液A:在培养箱中取出装有已自溶酵母的锥形瓶,经离心等操作后取上清液记体积为VA=19.5ml。

3、热提取液B:VB=15.0ml

4、乙醇沉淀提取液C:将热提取液B倒入100ml烧杯中,把烧杯放入冰浴中轻轻搅拌并慢慢加入(—20℃)95%乙醇溶液,35min后继续搅拌5min,离心,用5ml 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液溶解烧杯中的固体,与离心管中固体再一次离心,取上层清液,记体积为VC=6.2ml。

2.1.4 结果与讨论

2.1.4.1 结果

VA总=VA=19.5ml

VB总=VB·[VA/(VA-3)]=17.7ml

VC总=VC·[VA/(VA-3)] ·[VB/(VB-3)]=VC·[VB总/(VB-3)]=9.1ml

2.1.4.2 讨论

1、恒温水浴后,因设备原因未能及时取得足够的冰块,没能及时冷却,使得杂蛋白不能完全冷却变性析出,造成提取液纯度降低。

2、乙醇沉淀提取液C时,乙醇溶液的滴加速度稍快,且搅拌时间的缩短造成提取液C的浓度降低。

2.1.5 结论

本实验将20g鲜酵母通过化学裂解法使其自溶对蔗糖酶进行初提纯,得到初提液A19.5ml(3ml保存),热提取液B15ml(3ml保存),乙醇沉淀提取液

6.2ml(全部保存)。

2.2 蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法

2.2.1 实验原理

层析是利用不同物质的理化性质不同(吸附能力、分子形状、分子大小、极性、亲和力、分配系数)而建立起来的计数,所有层析系统都由固定相和流动相组成,混合物经过两相与其作用,最终分离。

离子交换层析原理:是以离子交换剂为固定相,以一定pH和离子强度的溶液为流动相,流动相和固定相之间发生可逆的离子交换反应,利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异,而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。

本法用的Q Sepharose-凝胶是以琼脂糖作为不溶性母体引入季铵型基团,为强阴离子交换剂。Q Sepharose-凝胶交换介质载量高,分辨率高,能承受较高的流速,化学稳定性好。在pH7左右时,Q Sepharose-凝胶带正电,而一般蛋白质在此酸度范围内带负电,两者可结合,降低pH或提高例子强度均可使之脱下来,当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时,达到分离的目的。

2.2.2 材料与方法

2.2.2.1材料

2.2.2.1.1试剂

①0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液;

②1mol/LNaCl的 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液;

③0.5mol/LNaOH;

④Q Sepharose,长期保存需置于20%乙醇中,4℃保存。

注:整个实验要注意避免高温,以防止酶失活。

2.2.2.1.2 器材

①层析柱;

②梯度混合器及搅拌子;

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