三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察
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三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察
中国兽医科学??2011,41(10):1056-1060
ChineseVeterinaryScience
中图分类号:R994.3??文献标志码:A??文章编号:1673-4696(2011)10-1056-05
三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统
重要组织器官损伤的病理学观察
常玲玲,朱金凤,岳??卓,苏丽芳,孙彦彦,丁??叶,田纪景,于??品,佘锐萍
(中国农业大学动物医学院,北京??100193)
????摘要:为探讨三聚氰胺对急性毒性试验中小鼠的胃、小肠和肝的损伤作用,将32只SPF级昆明小鼠随机分为4组,每组8只,雌雄各半,连续灌服不同剂量的三聚氰胺(0、175、350、700mg/kg),观察试验小鼠的临床表现,剖检死亡小鼠并取材,观察胃、小肠和肝的病理学变化。结果显示,各试验组小鼠48h内均全部死亡。光镜下可见死亡小鼠胃和小肠的黏膜层弥漫性坏死,肝细胞脂肪变性,肝小叶弥漫性淤血,甚至有片状出血灶,灶内肝细胞坏死。700mg/kg组小鼠的胃、小肠及肝血管内均可见多个黄色颗粒状结晶体沉着。在透射电镜下,175mg/kg和350mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆结构疏松,线粒体肿胀,700mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆中充满脂滴,线粒体弥漫性固缩。表明,三聚氰胺可引起小鼠胃肠黏膜发生急性弥漫性坏死,肝淤血,肝细胞变性,散在坏死,高浓度的三聚氰胺可在胃、小肠和肝间质中形成结晶体。
关键词:三聚氰胺;小鼠;消化系统;病理学观察
Pathologicalobservationoftoxiceffectofmelamineon
importantorgansofdigestivesystemofmice
CHANGLing-ling,ZHUJin-feng,YUEZhuo,SUL-ifang,SUNYan-yan,DINGYe,TIANJ-ijing,
YUPin,SHERu-iping
(DepartmentofAnimalMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)
????Abstract:Inordertoinvestigatethetoxicityofstomach,smallintestineandlivercausedbymelamine,32KMmicewererandomlydividedinto4groupsof8mice(male??female=1??1)ineachgroup.Allthemicewereadministratedorallywithdifferentdoses(0,175,350,700mg/kg)ofmelamine(MA),andtheclinicalresponsewasobserved.Whenthemicediedduringtheexperiment,anautopsywascarriedoutin-stantly.Thepathologicalchangesofstomach,smallintestineandliverwereobserved.Resultshowedthatallthemiceinexperimentalgroupdiedwithin48h,anddiffusenecrosisinmucosaofstomachandsmallin-testinewasobserved.Inliverinjury,fattychangesinhepatocytesanddiffusecongestioninlobuleoccurred,withlocalhemorrhageinsomemice.Moreover,manysmallyellowcrystallinesolidswereobservedinthebloodvesselsofstomach,intestineandliverin700mg/kggroup.Undertransmissionelectionmicroscopy,thecytoplasmwaslooseandthemitochondriawereswellinginthe175mg/kgand350mg/kggroup,whileinthe700mg/kggroup,thecytoplasmwerefullwithlipiddropletandthemitochondriadiffuselyshrinked.Inconclusion,melaminecaninduceacutenecrosisofstomachandsmallintestine,livercongestion,fattyde-generationandnecrosis.Highconcentrationofmelaminecanformcrystallinesolidsintheinterstitialofstomach,smallintestineandliver.
Keywords:melamine;mice;digestivesystem;pathologicalobservation
????三聚氰胺(Melamine,MA)是一种小分子有机
化合物,它作为一种重要的化工原料,被广泛用于日
收稿日期:2011-06-20;修回日期:2011-07-11
基金项目:国家自然科学基金项目(30270995;30471301)(),*-常生活用品的生产中,例如塑料、涂料及食品容器等。但是近几年部分不法商贩将其作为一种非法添
第10期????????常玲玲等:三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察1057
加剂掺入到食品中,其中2007年美国宠物粮中掺杂三聚氰胺导致数千只猫狗急性肾衰而死亡,2008年中国奶粉中掺杂三聚氰胺导致数万名婴幼儿出现尿结石。两起重大事件引起人们对三聚氰胺食品公共安全性的广泛关注,尤其是三聚氰胺对泌尿系统的毒性作用成为人们研究的焦点。但是三聚氰胺对其他系统组织器官的毒性作用很少有研究报道。本研究从病理学的角度探讨三聚氰胺对小鼠胃、小肠和肝的急性毒性损伤作用,以期为全面评估MA的毒性及食品饲料公共卫生安全性提供试验依据。
[1-4]
脱水,Epon812环氧树脂包埋,瑞典LKB-V型超薄切片机半薄切片(1??m)定位后,进行超薄切片
(50~70nm),醋酸铀和柠檬酸铅双染,日立H-600型电镜观察,拍照。
2??结果
2.1??临床表现
????各试验组小鼠精神沉郁,食欲下降,消瘦,被毛竖立,爬卧,运动迟缓,反应迟钝,24h后低剂量组有4只(2雄2雌)死亡,中剂量组2只死亡(1雄1雌),48h后各试验组小鼠全部死亡,死亡之前表现为弓腰爬卧,呼吸急促,严重者抽搐,昏迷,牙关紧闭。对照组未见异常变化。2.2??眼观病理学变化
????剖检死亡小鼠,可见胃内积食,胃壁高度肿胀,浆膜紧张,十二指肠和空肠肠壁菲薄,柔软失去弹性,肠内容物稀少。低、中剂量组有的小鼠肝呈暗红色,轻微肿大,高剂量组有的小鼠肝明显肿大,切面有暗红色血液流出。对照组未见明显异常。2.3??组织病理学变化
2.3.1??胃??对照组胃壁各层结构完整,细胞结构清晰,未见异常变化(见图1-1、1-2)。各试验组死亡小鼠无腺区角化层呈淡染状,黏膜下层高度水肿,肌层显著变薄(见图1-3),腺上皮细胞弥漫性肿胀坏死,腔中可见坏死组织碎片(见图1-4)。700mg/kg组黏膜层出现大片凝固性坏死灶,细胞结构消失,仅残存组织痕迹,呈均质红染状(见图1-5),而且在黏膜间质中可见数个黄色颗粒状结晶体沉着(见图1-6,箭头所示)。
2.3.2??小肠??对照组小肠各层结构完整,绒毛结构清晰,上皮细胞排列整齐,刷状缘清晰可见(见图2-1)。各剂量组死亡小鼠可见十二指肠和空肠段的绒毛溶解坏死(见图2-2),上皮细胞成片脱落或消失,固有层裸露,细胞数量显著减少(见图2-3),潘氏细胞胞浆中充满大而圆的红色透明颗粒,有的隐窝腔中充满红色均质样分泌物(见图2-4)。700mg/kg组有的小鼠整个黏膜层坏死,仅残存有肌浆层,肠腔中可见多量絮状坏死物(见图2-5),另外,黏膜层和黏膜下层可见数个细小黄色结晶体散在性沉着(见图2-6)。
2.3.3??肝??对照组肝小叶结构完整,肝索结构清晰,肝细胞未见异常(见图3-1),各试验组死亡小鼠可见肝小叶弥漫性淤血(见图3-2),肝细胞弥漫性脂肪变性或空泡变性(见图3-3),其中700mg/kg,1??材料与方法
1.1??试剂和仪器
????三聚氰胺:北京百灵威化学技术有限公司产品,化学纯,含量??99.0%;玉米油购自北京某超市;950mL/L乙醇、无水乙醇、二甲苯、多聚甲醛、戊二醛、包埋石蜡:北京广达恒益科技有限公司产品;苏木素、伊红:北京化学试剂公司产品。
????KD-BM生物组织包埋机:浙江省金华市科迪仪器设备有限公司生产;石蜡切片机:日本ERMA-INC公司生产;BH2生物显微镜:日本Olympus公司产品。
1.2??实验动物及处理
????SPF级昆明小鼠购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心,体重约22g,把小鼠随机分成3个试验组和1个对照组,每组8只,雌雄各半。试验组给药剂量从高到低分别是700mg/kg、350mg/kg和175mg/kg,将三聚氰胺研磨成粉状,根据不同的给药剂量,用玉米油分别配制成70mg/mL、35mg/mL和17.5mg/mL三种浓度的悬浊液,给药之前将悬浊液搅拌均匀,每只小鼠按照0.1mL/10g体重灌服,对照组给予玉米油,连续灌胃7d,并根据体重的变化调整给药量。试验期间,小鼠自由饮水摄食。
1.3??观察指标及方法
1.3.1??临床表现??给药期间密切观察并记录各组小鼠的精神状态、饮食量、被毛变化以及死亡情况。1.3.2??组织病理学观察??对给药期间死亡的小鼠进行剖检,分别摘取胃、小肠和肝,用25mL/L戊二醛-多聚甲醛混合液充分固定后,常规方法制成石蜡切片,HE染色,光镜下观察组织病理学变化,OLYMPUS显微镜拍照。
1.3.3??超微结构观察??取肝修成1mm3大小,用25mL/L戊二醛固定,PBS清洗3??15min,10??
1058中国兽医科学第41卷胞核固缩或消失(见图3-4),小叶间静脉及小叶间
胆管高度扩张(见图3-5),另外,有的小鼠肝窦高度扩张,窦腔和中央静脉中可见多量黄色颗粒状结晶体沉着(见图3-6)
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图1??小鼠胃病理组织学变化HE
Fig.1??Thehistopathologicalchangesofstomachinmice
1:对照组,胃无腺区100??;2:对照组,胃有腺区100??;3:低剂量组,肌层变薄100??;4:低剂量组,腺上皮细胞肿胀坏死400??;5:高剂量组,黏膜层出现大片凝固性坏死灶100??;6:高剂量组,黏膜下层可见黄色细小颗粒状结晶体沉着(箭头所示)400??
1:Controlgroup,noglandsarea100??;2:Controlgroup,glandsarea100??;3:Lowgroup,contractioninmucosallayer100??;4:Lowgroup,swellingandnecrosisoftheepithelialcells400??;5:Highgroup,coagulationnecrosisinmucosa100??;6:Highgroup,theyellowsmallcrystalsolidsinthemucosalmesenchyma400
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图2??小肠组织病理学变化HE
Fig.2??Thehistopathologicalchangesofsmallintestineinmice
1:对照组,未见异常变化200??;2:低剂量组,绒毛上端溶解坏死200??;3:低剂量组,绒毛上皮细胞成片脱落200??;4:中剂量组,固有层裸露200??;5:中剂量组,整个绒毛坏死消失200??;6:高剂量组,整个黏膜层坏死200??
1:Controlgroup,noabnormalchanges200??;2:Lowgroup,dissolvingnecrosisinthetopofvillus200??;3:theepithelialcellscameoff200??;4:Middlegroup,thelaminapropiaexposed200??;5:Middlegroup,thewholevillusdisappeared200??;6:Highgroup,necrosisinthewholemucosa200??
2.4??超微结构变化
????对照组肝细胞胞核大而空亮,结构清晰,胞浆
中充满多量线粒体和内质网,还可见核糖体、溶
酶体等其他细胞器(见图4-1)。175mg/kg和350性肿胀,内嵴断裂或模糊不清,粗面内质网排列紊乱(见图4-2);700mg/kg试验组肝细胞线粒体弥漫性固缩,内嵴结构模糊不清,外膜与周围基质之间可见明显空隙,胞浆中充满多量脂滴(见图
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第10期????????常玲玲等:三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察1059图3??肝病理组织学变化HE
Fig.3??Thehistopathologicalchangesofliverinmice
1:对照组,未见异常变化400??;2:低剂量组,弥漫性淤血400??;3:高剂量组,肝细胞弥漫性空泡变性200??;4:高剂量组,局部可见出血,肝细胞坏死400??;5:高剂量组,小叶间静脉高度扩张200??;6:高剂量组,血窦内可见多个黄色结晶体沉着(箭头所示)400??
1:Control,noabnormalchanges400??;2:Lowgroup,diffusecongestion400??;3:Highgroup,diffusevacuolardegenerationinthehepaticlobule200??;4:Highgroup,hemorrhagicfocusandnecrosisofthehepaticcells400??;5:Highgroup,angiectasiaintheportalarea400??;6:Highgroup,yellowcrystalsolidsinthehepaticsinusoid400
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图4??肝超微结构的变化
Fig.4??Theultrastructuralchangesoftheliverinmice
1:对照组,细胞结构正常10000??;2:中剂量组,线粒体弥漫性肿胀15000??;3:高剂量组,线粒体固缩12000??
1:Controlgroup,thecellularstructurewerenormal;2:Middlegroup,diffuseswellinginthemitochondria;3:Highgroup,diffusepyknosisinthemitochondria
3??讨论
????目前,人们普遍认为MA的毒性靶器官是肾和
膀胱,可引起肾炎和肾结石,以及膀胱炎、膀胱结石、
膀胱上皮细胞增生等[5]????本研究通过给小鼠灌服175、350、700mg/kgMA的急性毒性试验,发现MA不仅引起小鼠急性死亡,而且对胃、小肠和肝具有明显的毒性损伤作用。胃和小肠黏膜显著的病理学变化是凝固性坏死,而且呈明显的剂量相关性,提示MA对消化道
具有严重的刺激损伤作用。肝也出现明显的病理学
损伤,光镜下可见MA主要引起肝血液循环障碍,
肝小叶弥漫性淤血甚至出血,肝细胞出现脂肪变性、
,;。关于MA毒性研究的着眼点大多数仅集中于MA对动物泌尿系统的损伤及其结石形成机理的探索上,对其他系统的器官组织关注不多,而且很多报道仅限于大体观察的水[6-10]
1060中国兽医科学第41卷
ofmelamine[J].ChineseJournalofFoodHygiene,2008,20(6):535-537.(inChinese)
损伤线粒体。以上组织器官的损伤作用是否由于MA本身的刺激所致还有待于进一步的研究。
????目前研究认为,MA经血液循环进入肾后,在肾小管的浓缩作用下容易析出形成结晶体,进而引起肾损伤,但肾以外的系统或器官是否有结晶体形成很少有研究报道。杜边英等给Wistar孕鼠连续灌服400、800、1200mg/kgMA20d,在800和1200mg/kg组的肾和卵巢间质中均发现有结晶体形成。本研究发现700mg/kg组小鼠胃、小肠和肝间质中均有多量结晶体沉着,形态结构与肾中出现的类似[12],这对研究MA的成石规律及机体分布提供了一定的形态学依据。
????综上所述,在本试验条件下,MA可以引起小鼠胃和小肠黏膜急性弥漫性坏死,肝淤血,肝细胞变性,散在有坏死,并且高浓度的MA在胃、小肠和肝的间质中可形成结晶体。以上结果表明,MA对小鼠消化系统具有明显的毒性损伤作用。
[11]
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(责任编辑??胡弘博)??
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