ERp57在非酒精性脂肪肝中的作用

非酒精性脂肪肝

第48卷第2期

2014年4月哈尔滨医科大学学报JOUＲNALOFHAＲBINMEDICALUNIVEＲSITYNo．2Vol．48，Apr．，2014119EＲp57在非酒精性脂肪肝中的作用

王*辉，项夏霖，刘填桂，王苑芳

（广东省生物技术候选药物研究重点实验室，广东药学院生命科学与生物制药学院，广东广州510006）［摘要］目的探讨蛋白二硫化物异构酶A3（EＲp57）在非酒精性脂肪肝病中的作用。方法用1mmol/L脂肪酸混合物（油酸/软脂酸比例为2∶1）作用于人肝细胞L02构建脂肪肝细胞模型，采用ＲNA干扰技术在脂肪肝模型中抑制EＲp57表达。流式细胞仪和荧光显微镜观察抑制EＲp57表达后肝细胞

Westernblot技术检测脂代谢相关蛋白固醇调节元件流式细胞仪检测肝细胞凋亡情况，脂质堆积情况，

1）表达情况。结果结合蛋白（SＲEBP-Westernblot显示，EＲp57siＲNA转染L02细胞有效抑制了

抑制EＲp57表达通EＲp57表达，减少了L02细胞内脂质堆积，但对脂肪酸混合物诱导的肝细胞凋亡无明显影响。与对照siＲNA转染组相比，EＲp57siＲNA转染组肝细胞的SＲEBP-1蛋白表达下调。结论

1减少L02细胞内脂质堆积。过调节脂代谢相关蛋白SＲEBP-

［1关键词］蛋白二硫化物异构酶A3；非酒精性脂肪肝病；脂肪堆积；固醇调节元件结合蛋白-

［Ｒ575．5中图分类号］［A文献标识码］［1000－1905（2014）02－0119－05文章编号］

ＲoleofEＲp57innonalcoholicfattyliverdisease

WANGHui，XIANGXia-lin，LIUTian-gui，WANGYuan-fang

（GuangdongProvinceKeyLaboratoryofBiotechnologyDrugCandidates，SchoolofBiosciencesandBiopharmaceutics，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China）

Abstract：ObjectiveToinvestigatetheroleofproteindisulfide-isomeraseA3（EＲp57）in

NAFLDcellmodelwasinducedbyin-nonalcoholicfattyliverdisease（NAFLD）．Methods

cubatinganormalhumanhepatocytes-derivedcelllineL02with1mmol/Lfreefattyacids（FFAs）mixture（oleateandpalmitate，2∶1）．InvolvementofEＲp57proteininsteatosiswascharacterizedusingtheＲNAinterferenceapproachwiththesteatoticcells．CellulartotallipidaccumulationwasdeterminedafterNileＲedstainingbyfluorescencemicroscopeandflowcy-tometry．LipotoxiceffectswereevaluatedbyAnnexinV/PIstaining．Theexpressionoflipidmetabolismrelatedproteinsterolregulatoryelementbindingprotein1（SＲEBP-1）wasexam-inedbyWesternblotanalysis．ＲesultsInthesteatoticcells，knockdownofEＲp57expressionwithsiＲNAdidnottriggerapparentapoptosisbutsignificantlyreducedfataccumulation．West-ernblotanalysisshowedthattheexpressionofSＲEBP-1wasdown-regulatedinEＲp57siＲNA-trasfectedcellscomparedwithcontrolsiＲNA-trasfectedcells．Conclusion

protein．

Keywords：EＲp57；nonalcoholicfattyliverdisease；lipidaccumulation；SＲEBP-1KnockdownofEＲp57alleviatedhepaticsteatosisinL02cellsbydown-regulatingtheexpressionofSＲEBP-1

［收稿日期］2014－01－14

［基金项目］国家自然科学基金资助项目（81303292）；广东省自然

科学基金资助项目（S2012040007958）

［作者简介］王辉（1977－），女，黑龙江哈尔滨人，讲师，博士。

*通讯作者：E-mail：vera_wh@hotmail．com

非酒精性脂肪肝

120

哈尔滨医科大学学报第48卷

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholicfattyliverdis-ease，NAFLD）是一种排除过量饮酒和其他明确的肝损伤因素之外所致的类似酒精性脂肪性肝病理改变的综合征。随着生活水平的提高，与膳食结构、肥胖、代谢性疾病密切相关的NAFLD发病率逐渐增高，我国脂肪肝的发病率已占平均人口的10%，在

肥胖、

糖尿病高危人群中可高达50%～60%［1］

。NAFLD的发病机制至今不是十分明确，Day等

［2］

提出二次打击假说认为第一次打击主要是各

种病因导致肝细胞脂肪变（steatosis）形成单纯脂肪肝，此时脂肪肝患者没有或仅有轻微的炎症性改变；第二次打击是由游离脂肪酸增加形成氧化应激和肝细胞释放异常细胞因子，

导致单纯脂肪变性的肝脏发生炎症反应、坏死和纤维化，进而演变为脂肪性肝炎（nonalcoholicsteatohepatitis，NASH），而脂肪性肝炎的持续存在则不可避免地会发生进展性肝纤维化和肝硬化。尽管二次打击学说提出的基本概念目前已被普遍接受，但总体理论体系仍不够完整，对于造成脂肪堆积和脂毒性的具体分子机制仍未有明确阐述。

本研究前期用1mmol/L游离脂肪酸（freefattyacid，FFA）混合物（油酸/软脂酸比例为2∶1）作用肝细胞L02细胞24h建立了体外脂肪肝模型，利用二维电泳（two-dimensionalelectrophoresis，2-DE）为基础的蛋白组学技术观察到蛋白二硫化物异构酶A3（proteindisulfide-isomeraseA3，EＲp57/Grp58/EＲp60）在脂肪肝模型中表达上调。实时定量PCＲ技术也证实了这个蛋白的mＲNA变化与蛋白组学结果一致。利用免疫组化技术发现在17个脂肪肝患者的样品中有16个样品表达EＲp57，

5个健康人肝脏样品中无EＲp57表达，

统计学分析发现EＲp57的表达程度和强度与炎症级别和纤维化阶段分别相关

［3］

。EＲp57是内质网应激（EＲstress）时诱导的靶

分子蛋白［4］

，其表达提示内质网应激发生。内质网

应激触发的非折叠蛋白反应（unfoldproteinre-sponse，UPＲ）可激活脂代谢相关蛋白固醇调节元件结合蛋白-1（sterolregulatoryelement-bindingprotein，SＲEBP-1）的表达，增加肝脏脂肪酸的合成和积聚

［5］

。本研究在已有工作基础上，利用ＲNA干扰技

术特异性抑制EＲp57表达。检测EＲp57抑制后，肝细胞脂肪堆积和肝细胞损伤情况及SＲEBP-1表达情况，从而进一步明确EＲp57在NAFLD发病过程中的作用。

1材料与方法1．1

实验材料

1．1．1细胞株：人肝细胞株L02购自中国科学院细胞库。1．1．2

主要试剂：DMEM培养基，胰蛋白酶（Hy-

clone）；胎牛血清（GIBCO）；FuGENE高效转染试剂（Ｒoche）；EＲp57siＲNA和对照siＲNA，兔抗人SＲEBP-1单克隆抗体（SantaCruz，USA）；BCA法蛋白定量检测试剂盒和ＲIPA蛋白裂解液（碧云天）；兔抗人GAPDH单克隆抗体（Epitomics）；辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG购自美国CellSignaling公司；ECL发光试剂盒（Bio-rad）；尼罗红（NileＲed），油酸（oleicacid），软脂酸（palmitate）均购自Sigma公司。1．2方法

1．2．1

siＲNA体外转染：用FuGENE高效转染试剂

将EＲp57siＲNA和对照siＲNA分别转染至L02细胞内。L02细胞接种于6孔板，过夜培养后分别加入1.5mL的转染溶液（27nmol/LEＲp57siＲNA或对照siＲNA，6μLFuGENE转染试剂，无血清及抗生素的DMEM培养基）。37℃培养6h后补加1.5mL生长培养基（DMEM+20%胎牛血清），37℃继续培养42h。用1mmol/L脂肪酸混合物FFAs（ole-ate/palmitate比例为2∶1）继续处理24h，收集细胞即可用于流式细胞仪、Westernblot等检测。1．2．2

流式细胞仪测定细胞脂质堆积：尼罗红可对

脂肪特异性染色。消化转染72h的L02细胞，1000r/min离心5min，收集细胞后用冰PBS洗涤细胞2次。细胞重悬于1μmol/L尼罗红染液1mL，小心吹打混匀。室温避光放置30min染色，

1000r/min离心5min，重悬于1mLPBS，流式细胞仪（490nmexcitation/570nmemission）随机计数10000个细胞并计算平均荧光强度，实验重复3次。1．2．3

激光共聚焦显微镜观察细胞脂质堆积：转染

24h的L02细胞接种于放有盖玻片的35mm平板中继续爬片生长24h，用1mmol/L脂肪酸混合物FFAs培养24h后，细胞用1μmol/L尼罗红染液1mL室温避光染色15min，荧光显微镜观察细胞内脂肪堆积情况。1．2．4

流式细胞仪检测细胞凋亡：转染72h的L02

细胞胰酶消化收集，用PBS洗涤细胞2次（4℃1000r/min离心5min）。加入500μL的BindingBuffer悬浮细胞后分别加入5μLAnnexinV-FITC和

非酒精性脂肪肝

第2期王辉，等．EＲp57在非酒精性脂肪肝中作用的初步研究1215μLPropidiumIodide混匀，室温避光反应10min，

流式细胞仪检测，实验重复3次。

1．2．5Westernblot技术检测蛋白表达：收集转染

72h的L02细胞加入ＲIPA蛋白裂解液吹打均匀，

4℃14000r/min离心20min取上清。BCA法蛋

白检测试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白上样进行

SDS-PAGE后将蛋白转至硝酸纤维素膜上。膜用

5%的脱脂牛奶（TBST缓冲液配置）封闭30min，加

入特异性一抗4℃孵育过夜。新鲜TBST缓冲液重

复洗膜3次，每次5min。在含有辣根过氧化物酶标

记的二抗中室温孵育1h，新鲜TBST缓冲液重复洗

膜3次，每次5min。由ECL检测试剂盒进行化学

发光，暗室洗片，特异性蛋白条带显影于感光胶片

上

。22．1结果特异性EＲp57siＲNA转染抑制EＲp57表达EＲp57siＲNA转染L02细胞可有效抑制EＲp57表达（图1）。2．2抑制EＲp57表达对肝细胞脂质堆积的影响抑制EＲp57表达可减少L02细胞内脂质堆积（图2），细胞内红色荧光明显减弱（图3），在同等实验条件下对照siＲNA转染对脂质堆积无明显影响

。

图1Westernblot技术检测L02细胞EＲp57蛋白表达图2代表性流式细胞仪检测L02细胞内脂质堆积结果1：对照siＲNA；2：对照siＲNA+1mmol/LFFAs；3：EＲp57siＲNA；

4：EＲp57siＲNA+1mmol/LFFAs

图3荧光显微镜观察L02细胞内脂质堆积情况×400

A：对照；B：对照siＲNA+1mmol/LFFAs；C：对照+1mmol/LFFAs；D：EＲp57+1mmol/LFFAs

非酒精性脂肪肝

1222．3

抑制EＲp57表达对肝细胞损伤的影响

哈尔滨医科大学学报第48卷

胞的凋亡无明显增加，抑制EＲp57表达对脂肪肝细胞的损伤无明显影响（图4）。

1mmol/L的脂肪酸混合物处理24h后，与对照siＲNA转染组相比，EＲp57siＲNA转染组的L02细

图4代表性流式细胞仪检测L02细胞凋亡结果

A：对照siＲNA；B：对照siＲNA+1mmol/LFFAs；C：EＲp57siＲNA；D：EＲp57siＲNA+1mmol/LFFAs

2．41抑制EＲp57表达对脂代谢相关蛋白SＲEBP-

表达的影响

1mmol/L的脂肪酸混合物处理24h后，与对照siＲNA转染组相比，EＲp57siＲNA转染组肝细胞的SＲEBP-1蛋白表达下调，抑制EＲp57表达通过调节1减少L02细胞内脂质堆脂代谢相关蛋白SＲEBP-积（图5）

。

血症、胰岛素抵抗等通过下述一种或多种因素导致

脂肪肝：肝脏摄取游离脂肪酸增加；肝合成游离脂肪酸增加或由碳水化合物合成甘油三酯（triglyceride，TG）增加；脂肪酸在肝线粒体内氧化和利用减少；极低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein，VLDL）合成和分泌减少，导致TG转运障碍。国内外相关

［7-8］

。研究发现内质网应激与NAFLD发病机制相关

内质网是真核细胞内重要的细胞器，是蛋白质合成、

折叠、组装、运输和细胞内钙储存的主要场所，同时

［9］

参与脂肪酸代谢和类固醇激素的合成。由于外界环境刺激而导致的错误折叠与未折叠蛋白质在内

2+

质网腔内聚集以及Ca平衡的紊乱可导致内质网应激

图5

Westernblot技术检测L02细胞SＲEBP-1蛋白表达

1：对照siＲNA+1mmol/LFFAs；2：对照siＲNA；3：EＲp57siＲNA；4：EＲp57siＲNA+1mmol/LFFAs

［10］

。内质网应激时机体启动一种自我保护反

——即UPＲ［11］。UPＲ可监控蛋白质折叠和应机制—装配情况，并将信息传递至细胞质及细胞核中，然后通过上调一系列内质网分子伴侣和折叠酶的表达，使球蛋白合成减少，并能促进错误折叠和未折叠的使内质网恢复稳态。然而过度蛋白质折叠或降解，

的内质网应激则将使UＲP无法代偿，大量未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网腔中堆积，内质网稳态

［12］

被进一步破坏，最终导致细胞功能障碍或死亡。1同时，内质网应激可活化脂代谢相关蛋白SＲEBP-SＲEBP-1是甘油三酯代谢中的重要转录因的表达，

3讨论

非酒精性脂肪肝疾病谱包括单纯肝脂肪变性、

非酒精性脂肪性肝炎以及肝硬化三种主要类型，其中肝脂肪变性的发病率最高且组织学改变通常是可

逆的，因此早期治疗肝脂肪变性以防止其进一步发展更为迫切可行

［6］

。各种致病因素包括饮食、高脂

非酒精性脂肪肝

第2期王辉，等．EＲp57在非酒精性脂肪肝中作用的初步研究

123

子，活化的SＲEBP-1进入核内，可在转录水平上调控多个脂质代谢中与脂肪酸和甘油三酯合成有关的

关键酶［13-14］，增加肝脏脂肪酸的合成和积聚［5］

，其在肝脏过表达导致肝细胞脂变

［15］

。

在非酒精性脂肪肝的体外研究中以添加脂肪酸

为最常见的方法。研究发现不同比例的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸来培养肝细胞，可引起一系列代谢

改变并最终导致肝细胞脂肪变性和肝损伤［16］

。前期研究中即用1mmol/L游离脂肪酸混合物（油酸/软脂酸比例为2∶1）作用肝细胞系L02细胞24h建立了脂肪肝细胞模型。利用此模型进行后续研究发现脂肪肝细胞及脂肪肝患者的组织样品中蛋白EＲp57表达上调［3］。研究证实EＲp57蛋白与多种疾病包括肿瘤、阮病毒疾病、阿尔茨海默病相关［17］

，但EＲp57蛋白与NAFLD的关系，目前未有报道。本实验通过siＲNA干扰技术在脂肪肝细胞模型中抑制EＲp57表达并证实下调EＲp57蛋白可减少脂肪酸混合物诱导的L02细胞内脂质堆积。EＲp57是

内质网应激时诱导的靶分子蛋白，

其表达上调提示内质网应激发生。内质网应激可活化脂代谢相关蛋

白SＲEBP-1的表达，本研究发现与对照siＲNA转染组相比，

EＲp57siＲNA转染组肝细胞的SＲEBP-1蛋白表达下调，提示抑制EＲp57表达通过调节脂代谢

相关蛋白SＲEBP-1减少L02细胞内脂质堆积。此外，

内质网应激过强或时间过久可通过激活caspase、C-JunN端激酶（JNK）等途径诱导细胞凋亡

［7］

，已有研究报道脂肪酸（特别是饱和脂肪酸）可

诱导肝细胞内质网应激并引起肝细胞凋亡

［8，18］

。本实验证实与对照siＲNA转染组相比，

EＲp57siＲNA转染组脂肪肝细胞的细胞凋亡率无明显改变，说明抑制EＲp57表达对肝细胞损伤无明显影响。内质网应激诱导非酒精性脂肪肝已进一步被研

究者的实验证实

［19-20］

。但内质网应激相关蛋白EＲp57与非酒精性脂肪肝的关系研究未见进一步报

道，

基于本研究推测EＲp57的高表达可能与内质网应激信号通路活化相关。下一步研究将深入探讨EＲp57蛋白通过哪些具体环节参与内质网应激及NAFLD发病过程。

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