线粒体制备及线粒体通透性转换孔检测
上传者:陈以农|上传时间:2015-05-10|密次下载
线粒体制备及线粒体通透性转换孔检测
心肌线粒体的制备
采用差速分级离心法分离线粒体。取上述处理后的心脏置于预冷的匀浆介质 (16ommol/LKCI, 10mmol/LEDTA,0.5%牛血清白蛋白,pH7.4)中尽快剪碎,用组织匀浆机制成10%匀浆,在4℃下,以1000*g离心10min,弃沉淀,上清液于4℃,8000*g离心10min;弃上清液,沉淀用重悬液(320mmol/L蔗糖, l0mmol/LTris一HCI,pH7.4)重悬后再次于4℃, 8000*g离心10min。所得沉淀即为线粒体。线粒体置于重悬液中用考马斯亮兰蛋白测定法测定蛋白含量。
线粒体渗透性转换的检侧
取线粒体用肿胀液 t(120mmol/LKCI,20mmol/LM0pS,10mmol/L Tris一Hcl, 5mmol/LKH2PO4,pH7.4)稀释至0.25g/L蛋白质,于25℃, 200μmol/L的 CaC12作用于线粒体,连续观察520nm处线粒体吸光度(A520)的变化15min,30个循环。该变化反映线粒体肿胀程度,提示MPTP的开放情况。
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