病毒诱导的基因沉默

病毒诱导的基因沉默

摘要:病毒诱导基因沉默（Virus induced gene silencing ,VIGS）是近年发现的一种转录后基因沉默的现象，是快速鉴定植物基因功能的一种反向遗传学新技术，近年来成为植物基因功能研究的有力工具。文章从病毒诱导基因沉默的发现、类型、作用机制、优势及不足、影响条件及对发展前景的展望等方面进行了综述。

关键词:病毒诱导的基因沉默；机制；应用；基因功能

RNA介导的基因沉默(RNA- mediated gene silencing)是一种通过核酸序列特异性的相互作用来抑制基因表达的调控机制，它广泛存在于各种生物中,在植物中称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing , PTGS)[1]。病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing ,VIGS)属于转录后的基因沉默，指携带植物功能基因cDNA 片段的重组病毒，在侵染植物体后诱导植物发生基因沉默而出现表型突变，可以通过植物表型或生理指标上的变化来反映该基因的功能.VIGS是20世纪90年代新兴的一种技术，发展迅速，已广泛应用于生物学诸多领域的研究。

1 VIGS的建立与发展

VIGS一词最早出现于van Kammen[2]对病毒侵染后产生的回复现象的描述，现已成为描述应用重组病毒抑制内源基因表达的专门词汇[3]。最早的VIGS体系采用的病毒载体是典型的RNA病毒。1995年，Kumagai等人[4]在烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)上插入了一段八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS) cDNA片段，当TMV重组病毒侵染烟草后，侵染植物的叶片变成白色，研究表明被感染植株产生的白化效应是因为PDS mRNA水平显著降低引起的。PDS是类胡萝卜素合成途径中的一个关键酶，而类胡萝卜素在植物中具有光保护的作用，类胡萝卜素合成途径被阻断导致植物光保护功能的丧失，从而引起白化效应。1998年，Baulcombe研究组[5]在马铃薯X病毒(Potato X virus，PVX)基因组上同样插入了一段PDS cDNA，重组病毒侵染植物后也出现了失去光保护作用的白化效应,由此他们提出VIGS可以有效地抑制植物内源基因的表达,从而可以利用病毒载体进行未知基因的功能鉴定。2001年，Baulcombe研究组[6]又报道了以烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)为载体的VIGS体系，发现无论在抑制转基因还是内源基因的表达上，TRV载体诱导基因沉默的效率和持久性都优于PVX载体，TRV本身产生的症状也轻于PVX。目前，TRV病毒载体已在番茄(Solanum lycopersicum)、烟草(Nicotinaspp.)、矮牵牛(Petunia hybrida)、辣椒(Capsicum spp.)、

拟南芥和棉花(Gossypium spp.)等多种植物上被广泛应用。1998年, Robertson研究组[6]利用双生病毒科的番茄金色花叶病毒(Tomato golden mosaic virus, TGMV)初步建立了以DNA病毒诱导的基因沉默来研究植物基因组功能的体系。利用TGMV的DNA-A为载体在本氏烟上先后成功诱导了镁离子螯合酶的关键基因Su(Sulfur)和转荧光蛋白基因(luc)发生沉默，从而在叶片上出现黄色突变表型和转luc基因植株不再发出荧光。随后,非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus, ACMV)和棉花皱缩病毒(Cotton leaf crumple virus, CLCrV )载体相继在木薯和棉花中得到成功应用, 这可能将极大地促进木薯和棉花的功能基因研究[7,8]。继RNA病毒和DNA病毒作为载体的VIGS体系之后，Gossele等人[9]又发展了一种基于卫星病毒的VIGS体系, 他们对伴随TMVU2的卫星病毒(STMV)基因组进行了改造,使其具有插入外源片段的能力，通过在烟草上对PDS等13个植物内源基因的测试结果表明，STMV载体能够有效抑制这些基因的表达并呈现明显的表型突变。由于卫星病毒的基因组具有在植物中复制水平高以及本身基因组小，且在实验中容易操作等特点，使其成为一种优良的候选沉默载体。 2 VIGS的作用机制

基因沉默在生物中普遍存在，其作用表现在抵御病毒、转座子等外来核酸的入侵，识别并抑制外源基因表达，维持生物基因组稳定性等（Baulcombe，2004）。VIGS作为基因沉默的特殊形式，是植物抗病毒侵染的一种自然机制。当病毒或携带cDNA的病毒载体侵染植物后，在复制与表达过程中通常会形成双链RNA（Double stranded RNA，dsRNA）形式的中间体。dsRNA作为基因沉默关键激发子，首先在细胞中被类似RNase Ⅲ家族特异性核酸内切酶Dicer类似物（如DCL4）切割成21 ~ 24 nt的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）（Llave，2010）。siRNAs 在植物细胞内被依赖RNA的RNA聚合酶1（RNA-dependent RNA polymerase 1，RDR1）、RDR2 或RDR6进一步扩增（Donaire et al.，2008），并以单链形式与Agronaute1（AGO1）蛋白等结合形成RNA 诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC 特异地与细胞质中的同源RNA互作，导致同源RNA降解，从而发生转录后水平的基因沉默（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）（Brodersen et al.，2008；Qu & Morris，2008；Llave，2010）；RISC 特异地与细胞核内同源DNA相互作用导致其被甲基化等修饰，从而发生转录水平的基因沉默（Transcriptional gene silencing，TGS）（Zheng et al.2007；Llave，2010）。

3 VIGS类型

3.1 RNA病毒诱导的基因沉默

RNA病毒诱导的基因沉默是目前研究比较深入的一种基因沉默。2001年，Ratcliff et al[ 10 ]

报道了以烟草脆裂病毒( Tobacco rattle virus, TRV)为载体的V IGS体系，并比较了TRV和PVX诱导转基因GFP、转基因GUS、内源基因PDS、Rubisco小亚基和LEAFY开花基因发生基因沉默的效率和持续时间，研究发现无论在抑制转基因还是内源基因的表达上，TRV诱导基因沉默的效率和持续性都优于PVX，同时，TRV产生的病毒症状也轻于PVX。2002年，Holzberg et al[ 11 ]以大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV)为载体，首次在单子叶植物大麦上成功抑制了PDS基因的表达。2004年，又报道了以豌豆早枯病毒( Pea early browning virus，PEBV)为载体的V IGS体系，这是第1个可应用于豆科植物基因沉默的V IGS载体[12]。其中，TRV是应用最广的VIGS载体，被应用于本氏烟、番茄、拟南芥和马铃薯等多种植物。该载体目前有3个版本，即最早由Ratcliff et al构建的版本、Liu et al[13]改进的版本pYL156和pYL279，以及Valen2tine et al[14]的TRV22b版本。其中，Liu et al的版本插入了双倍CaMV35S启动子，在C端插入了1个核酶，可导致更有效的病毒RNA的产生；而TRV22b与前2个版本的区别在于TRV22b保留了TRV RNA2中的2b基因序列。不同版本的TRV载体在适用植物范围以及可沉默植物组织等方面有显著区别。Ratcliff et al的版本目前只用于本氏烟(Nicotiana benthamiana)和茄属(Solanum )的3个种；而pYL156则除了应用在本氏烟和茄属的2个种外；还适用于番茄、烟草、辣椒等作物，但不能诱发马铃薯栽培品种卡拉产生有效的基因沉默[15]。而TRV22b则导致植物根部和顶端分生组织中产生比上述2种TRV更好的基因沉默效果。

3.2 其它病毒诱导的基因沉默

与上述RNA病毒类似, DNA病毒也能诱导基因沉默。1998年，北卡罗那州立大学

Robertson研究组[16]利用双生病毒科的番茄金花叶病毒( Tomato golden mosaic virus, TGMV) DNA2A为载体，在本氏烟上成功诱导了镁离子螯合酶关键基因Su ( Sulfur)和转基因luc荧光蛋白基因沉默，从而初步建立了以DNA病毒诱导的基因沉默研究植物病毒功能的体系。但是TGMV DNA2A载体诱导基因沉默后的效率比较低，并且病毒本身会产生严重的病毒症状。因此在2001年，Robertson研究组[17]又报道了以TGMV DNA2B为载体的VIGS体系，该载体在基因沉默效率和持久性上都比DNA2A强，在植株中产生的病毒症状也有所减轻。2002年，Turnage et al[18]利用甘蓝曲叶病毒(Cabbage leaf curl virus, CbLCV)在拟南芥上成功建立了VIGS体系。非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus, ACMV)也是最近报道的VIGS载体。上述3种均为单链环形DNA病毒,由DNA2A和DNA2B 2种组分组成，已分别被应用于本氏烟、拟南芥和木薯的基因沉默研究[19]。与RNA病毒类V IGS载体相比， DNA病毒类VIGS载体的优点是侵染性克隆构建简单，无需转录，稳定，易于操作，但基因沉默效果不如RNA

病毒类VIGS载体。

以RNA病毒和DNA病毒为载体的VIGS体系建立后，2002年，Gossele et al[20]对TMVU2的卫星病毒(Tobacco mosaic satellite virus, TMSV)基因组进行改造，使其具有插入外源片段的能力，从而建立了一种基于卫星病毒的V IGS体系。该体系能有效地抑制烟草PDS等13个植物内源基因的表达并呈现明显的突变表型。2004年，陶小荣等[21]在对中国番茄黄曲叶病毒( Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)的研究中，分离和鉴定了一种新型的DNA卫星分子(DNAβ)，并对DNAβ上的βC1基因进行了缺失和引入多克隆位点(multiple cloning sites, MCS)，将其改造成为一种DNA卫星载体。该载体可以有效地抑制转基因GFP的表达，也可以高效地抑制内源基因PDS和Su的表达，可应用于多种茄科植物的VIGS分析[21 - 24] 。同时，该载体自身基因组小，载体构建操作相对容易，且对高温不敏感，非常适用于维管束组织特异性表达基因的VIGS分析[ 23, 24 ]。

4 VIGS有关的实验方法

4.1 VIGS环境条件的控制

成功的基因沉默依赖于病毒在植物体内的传播和植物生长之间的相互作用，而这2个方面都受到环境条件的影响(Burch-Smith等2004)。对于病毒的传播和有效的沉默，温度是最重要的影响因子之一。而对于不同的植物，有效沉默所需要的温度也可能不同。例如，用TRV 感染番茄，较好的沉默表型在22 ℃或更低的温度下发生；而用TRV感染烟草，合适的温度则在25 ℃左右(Burch-Smith等2004；Ekengren等2003；Liu等2002a；Nethra 等2006)。目前的研究证明，植物培养室(growth chamber)是进行VIGS 实验较为理想的选择，而控温较差和温度波动大的温室不适宜于做VIGS实验。另外，Fu等(2006)发现，低温和低湿的条件可以增强基因沉默的强度和延长沉默的持续时间。

4.2 设计合理的实验对照

对于每个VIGS实验，都必须要有合适的对照来监控沉默的效果。阳性对照通常采用八氢番茄红素脱氢酶( phytoene desaturase，PDS)基因的沉默，因为PDS沉默能引起沉默区域发生光漂白，并迅速产生可见的表型(Kumagai 1995)。也有一些研究选用镁离子螯合酶

(magnesium chelatase)基因作为阳性对照(Kjemtrup等1998；Peele等2001)。实验中，为了说明病毒自身是否会引起表型，还必须用空病毒载体接种植物作为阴性对照。另一方面，阴性对照也可以显示接种技术对植物生长的影响。我们在实验中观察到，较强烈的接种处理对植物自身生长可能会产生一定的影响，如真空渗透处理番茄幼苗10 d左右的时间内，对番茄植株的生长具有较明显的抑制。如果阴性对照(空病毒载体接种的植物)出现非正常的表型，往往

还需要添加新的阴性对照，即以不含病毒载体的水或侵染缓冲液采用相应的接种技术处理植株。以便明确非正常的表型是来自于病毒自身的原因，还是由于接种方式引起的，从而可以进一步选择合适的方法或优化条件来消除此不利影响。另外，阴性对照对后继的沉默检测也是必不可少的，所有的检测都应该以接种空病毒载体的阴性对照材料作为检测的阴性对照。 5 病毒诱导基因沉默（VIGS）的优缺点

随着基因组计划的实施,越来越多的未知基因功能有待进一步鉴定。在筛选植物功能基因上，一般是通过T2DNA和转座随机插入植物基因组获得突变体，预期从表型突变上来筛选相关功能基因。在拟南芥系统上，这是一种筛选基因、鉴定功能的有效方法，但其周期长、工作量大、过程繁琐，而且完全依赖于转基因体系的成熟。VIGS研究基因组功能的优点在于周期短、成本较低、可在不同的遗传背景下生效，一般从构建重组载体到农杆菌浸润接种植物进行功能鉴定只需几个星期时间，因此既节省时间又节省人力和物力，可以较大规模进行基因组序列的功能鉴定。在筛选植物功能基因上，传统的方法是通过植物表型突变筛选基因。VIGS可以对成熟期的植物进行诱导并产生表型突变，从而对致死基因的功能进行研究。 对多基因家族的基因功能进行研究，传统的插入突变通常只能导致1个多基因家族中1个成员突变，其功能可以通过其它成员来弥补，可能不产生预期的表型，从而无法研究家族成员的功能。而VIGS可以解决这些问题，它可使序列差异为10% -20%的同源基因发生沉默，只要选取所有家族成员的高保守区，就能沉默整个家族成员。VIGS能够快速用于比较物种间多个基因的功能，例如用TRV-VIGS载体研究MAPK和COLL在番茄抗细菌反应和本氏烟抗病毒反应中的功能。尽管VIGS有诸多的优点，但是这种方法也存在一些弊端和不足。主要表现在: (1) VIGS很少能够完全地抑制一个基因的功能。对于某些靶基因，虽然有部分的沉默，但是未沉默的基因有可能产生足够的功能蛋白，因此并不能观察到典型的沉默表型；(2)如果没有全基因组序列或是足够的EST信息，通过VIGS将不可避免地遇到基因家族中功能冗余的干扰；(3)大部分的VIGS表型不具遗传性，所以无法应用于种子萌发或在幼苗生长早期表达的功能基因研究；(4)基因沉默的效率或是沉默的表型并不是非常稳定。在不同的实验和不同的植株中，结果可能并不完全一致，解决这个问题的方法一般是在实验中设置一个沉默后可见表型的标记基因作为阳性对照。另外VIGS的病毒载体有限且有些病毒载体本身也能在植物的生长过程中出现某些症状或在生理上产生一些变化，因此在分析VIGS沉默表型时，要注意这些因素对突变表型的干扰。因而进一步了解病毒与宿主的相互作用机制，从更深水平上认识沉默过程中载体与目的基因的变化规律对于VIGS系统在植物基因功能上的研究具有非常重要的意义。