去细胞异种神经复合骨髓基质干细胞修复周围神经缺损的实验研究

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去细胞异种神经复合骨髓基质干细胞修复

周围神经缺损的实验研究

景尚斐温树正王继宏

【摘要】

ｎ＇ｌａｒｒｏｗｓｔｅｍ

樊东升郝增涛

冀云涛杨晨瑗

ｎｅｒｖｅ，ＡｘＮ）复合骨髓基质干细胞（ｂｏｎｅ

目的探讨去细胞异种神经（ａｃｅｌｌｕｌａｒ

ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ

ｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）修复周围神经缺损的效果。方法体外培养大鼠ＢＭＳＣｓ；取雌性Ｗｉｓｔａｒ大鼠

６０只，随机分为３组，每组２０只，建立右坐骨神经１０ＩＩｍ缺损修复模型。Ａ组：ＢＭＳＣｓ与ＡＸＮ复合修复神经缺损；Ｂ组：单纯ＡＸＮ修复神经缺损；ｃ组：自体神经移植组。术后４、１２周依次进行干细胞的转归、移植免疫、神经电生理检测、新生神经组织学观察和小腿三头肌肌纤维横径等检测，判断坐骨神经功能恢复情况。结果术后移植物内均可见细胞生长，Ａ、ｃ组细胞数目较多，排列整齐，只有Ａ组Ｓ－－１００免疫组化染色阳性细胞内可见ＢｒｄＵ阳性表达，术后１２周再生神经已通过远端缝合口。Ａ组、ｃ组组织学及电生理检测指标均优于Ｂ组（Ｐ＜０．０５），Ａ组与Ｃ组差异无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。结论ＢＭＳＣｓ作为种子细胞可以在体内存活，并可分化为ＳＣｓ，其与ＡＸＮ复合构建组织工程神经修复神经缺损的效果接近于自体神经移植。

【关键词】神经再生；许旺细胞；骨髓基质干细胞；去细胞异种神经

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周围神经缺损的修复一直是外科领域致力解决的难题之一。近年来，随着组织工程学与转化医学的快速发展，组织工程神经为神经缺损的修复提供了新的修复思路，已有大量文献报告‘ｌ圳，同种异体

去细胞神经基膜管修复神经缺损已取得了较满意的效果，但供体紧缺，这促使我们进行异种去细胞神经

移植的尝试。本课题通过设计ＢＭＳＣｓ复合ＡＸＮ构建组织工程神经修复周围神经缺损的实验研究，探讨一种新的周围神经缺损的修复思路。

材料与方法

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．Ｊ．ｉｓｍ．１００５－０５４Ｘ．２０１２．０２。０２０

基金项目：内蒙古医学院２００６年学院重大课题（ＮＹ２００６ＺＤ０１０）作者单位：０１００３０呼和浩特，内蒙古医学院第二附属医院手显二科

一、√蚓的制备及免疫学检测

取６个月龄日本大耳白兔２０只（内蒙古大学动

通信作者：温树正，Ｆａｍｉｔ：ｎｒａｇｗｓｚ＠ｙｍｈｏｏ．ｏ㈨．Ｃｌ＇ｉ

物中心提供），手术切取双佻胫神经，截成１５锄长

万方数据

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１１３

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的神经段，置于４℃蒸馏水浸泡２４ｈ，转入恒温３７。Ｃ水浴摇床下依次３．０％ＴｒｉｔｏｎＸ．１００试剂６ｈｉ５Ｊ、４．０％锇脱氧胆酸钠６ｈ、ＰＢＳ缓冲液６ｈ，反复３次，然后ＰＢＳ缓冲液洗３次，置于含青霉素、链霉素的ＰＢＳ液中，４℃冰箱保存备用，并对ＡＸＮ进行形态学观察和免疫学检测。

二、ＢＭＳＣｓ的培养、鉴定、标记并与ＡＸＮ复合手术抽取１２只Ｗｉｓｔａｒ大鼠（内蒙古大学动物中心提供）红骨髓，采用全血培养法进行ＢＭＳＣｓ的培养［６－ｓ］，通过生长特性观察及细胞表型检测对培养的ＢＭＳＣｓ进行鉴定；取第５代ＢＭＳＣｓ，消化后以１×

１０４几密板中度接种于６孔爬片，同时随培养液一同

加入终浓度为１０

ｐｍｏｌ／Ｌ的Ｂ舢溶液，孵育４８

ｈ后

取出爬片固定，避光ＨＥ染色，光镜结合免疫荧光显微镜４０倍视野下观测ＢＭＳＣｓ核的ＢｒｄＵ标记情况，在显微镜视下随机选取１０个非重叠的视野进行计数，阳性率＝阳性细胞数／视野总细胞数ｘ１００％，计算标记的阳性率。将制备好的ＡＸＮ置于含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液中预处理１２ｈ，通过微注射法将ｌ×１０４／ｍｌ的ＢｒｄＵ—ＢＭＳＣｓ细胞悬液（含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液）注入ＡＸＮ内，在等浓度细胞悬液中混合培养２４ｈ后手术移植到大鼠坐骨神经缺损处，部分组织避光、４％多聚甲醛固定２４ｈ，包埋、切片，免疫荧光显微镜视下观察细胞复合情况。

三、建立缺损神经缺损模型及实验分组取Ｗｉｓｔａｒ大鼠６０只（内蒙古大学动物中心提供），随机分为３组，每组２０只。Ａ组：ＡＸＮ复合ＢＭＳＣｓ修复神经缺损；Ｂ组：单纯ＡＸＮ修复神经缺损；Ｃ组（对照组）：自体神经移植。手术于梨状肌下缘切断右坐骨神经造成１０ｍｍ缺损，手术切去的神经组织以４％多聚甲醛固定。１０—０尼龙线于显微镜视下４针等间距缝合神经外膜，Ａ、Ｂ组选用对应移植物，Ｃ组将截取的自体神经远近端翻转后原位缝合神经外膜。以上步骤结束后，抗生素生理盐水冲洗手术操作区域，分层缝合，抗生素手术野浸润注射，术后大鼠分笼饲养，通过对动物一般情况观察、免疫学检测、肌电生理检测、组织取材形态学观察等来评价神经修复效果。

四、统计学处理

各组数据用牙±ｓ表示，采用ＳＰＳＳ１４．０软件进行ｔ检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

结

果

一、ＡＸＮ形态学观察及免疫学检测万方数据

ＡＸＮ呈淡乳白色略透明的圆柱状外形，两端无

膨出的轴突髓鞘。其外径及长度无明显改变，神经的延展性略有增加，神经外膜的韧性、弹性与新鲜神经基本一致。ＨＥ纵切片见红染的神经膜波浪状排列，空隙内无任何细胞结构和组织碎片；ＳＥＭ显示神经的细胞成分、轴突及髓鞘消失，而管状ＳＣｓ基底膜保留完好（图ｌａ、ｂ），流式细胞仪ＭＨＣ．Ⅱ检测结果经统计分析显示：新鲜神经ＭＨＣ．Ⅱ蛋白表达量（ｘ．

Ｍｏｄｅ）为（３８．６５±１６．７３），ＡＸＮＭＨＣ一Ⅱ蛋白表达量

（Ｘ．Ｍｏｄｅ）为（１．９７±１．５２），两组间差异有统计学意义（ｔ＝８．４５９，Ｐ＜０．０５），说明ＡＸＮ较新鲜神经免疫原性明显降低。

二、ＢＭＳＣｓ的培养、鉴定、标记及与ＢＭＳＣｓ．ＡＸＮ复合情况观察

我们对ＢＭＳＣｓ通过生长特性观察、细胞表型

ＣＤ３４、ＣＤ４４及ＣＤ９０的表达进行鉴定，结果显示：细

胞生长良好，符合ＢＭＳＣｓ特性。ＢＩｄｕ标记ＢＭＳＣｓ

４８垢，显微镜视下见细胞生长良好，融合达８０％，

胞核阳性标记率达８８．３６％（表１，图２ａ—Ｃ）。ＢＭＳＣｓ通过微注射法和共同培养法与ＡＸＮ复合２４ｈ，组织切片免疫荧光镜视下观察见ＡＸＮ波浪状排列的纤维间隙内散在着ＢｒｄＵ．ＢＭＳＣｓ。

三、术后动物坐骨神经修复效果评价

术后所有动物患肢感觉、运动功能全部丧失，饲养过程中无一例死亡，手术切Ｅｌ无感染发生，创口１周后愈合。术后２周部分实验动物开始足底皮肤干燥，出现溃疡，无针刺反应。４周外周血ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ细胞增殖三组间差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５，表１）。１２周时Ａ、Ｃ组足底溃疡全部愈合，针刺反应明显，患肢足趾己经可以伸展，电刺激移植段近侧神经，于胫骨后肌群可记录到运动诱发电位，与对侧正常神经比较，其潜伏期延长，波幅较低；神经传导速度优于Ｂ组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；Ａ组与Ｃ组比较，两者差异无统计学意

义（Ｐ＞Ｏ。０５）。

术后４周免疫组化染色见各组移植段内均有细

胞生长，以Ａ、Ｃ组细胞量较多且排列较整齐，类似

Ｂｕｎｇｅｒ带（图３ｂ～ｄ），Ｓ．１００蛋白阳性率较Ｂ组差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５），免疫荧光显微镜视下见只有Ａ组Ｓ．１００阳性细胞其细胞核有ＢｒｄＵ荧光阳性表达（图３ｃ），神经纤维呈束状排列通过远端缝合

口。

术后１２周，ＳＥＭ观察移植段神经内均可见ＳＯｓ一轴突复合体，Ａ、Ｃ组再生神经纤维数目多，神经纤维

１１４?

生堡主±｝叠壁查垫１２至±旦璺垫鲞蓥２翘￡毡！』丛！鲤鱼韭ｔ蛔！垫！！：！堂：垫ｔ丛：２

裹Ｉ术后４周大鼠外周血Ｔ细胞亚群分析（ｊ±Ｊ，ｎ＝ｌＯ）

顽百可可———————两——

ＣＤ３ＣＤＩ

ＣＤ８

日组６６．∞±７．鼹

４０

ｃ组

６７．６２±７．７０４１．５５±４．２１２７．５１±３．６６１．５２±０．１５

非呈查组

６７．１３±７．１０

４０

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０．０３８

０．１５４０．３９６

￡笪

０．９６２０．８５８０．６＂／７

６７．２２±７．押４０．９４±４．（１３

５２±４．３５

１９±４．８５

２６．２９±３．救

１．５７±０．１７

２６．１７±３．７２

１．５６±０．１５

２６３９±３．４７１．６６±０．３３

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Ｏ．２帅０．７５１

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圈１兔胫神经去细胞神经基膜管形态学观察见细胞及细胞成分硝失，基底膜、纤维等支架呈纵向排列ａＨＥ光镜纵切ｘ４０ｂ，ｃ扫描电镜纵、横切ｘ１２０００围２大鼠ＢＭＳＣｓＣＤ４４免疫组化染色阳性ａ光镜流式细胞仪检测ＣＩ）９０阳性ｂｍｄｕ一删ｓｃＢ阳性标记ｃ免疫荧光显微镜

ｘ４００

ｘ４００图３术后４周远端缝合口有神经纤维通过＾Ｓ－１００免疫组化染色光镜纵切

ｄ横切ｘ４∞圈４术后１２周远端缝合口可见有神经纤维通过ａ扫描电镜横切

ｘ

ｂ纵切ｘ４００ｃ免疫荧光显傲镜纵切

ｘ７∞０ｂ横切ｘ３００００

１００

粗大，束问结缔组织少．再生髓鞘内板层致密，髓鞘明显增厚（图４ａ、ｂ）．Ｂ组纤维断面形态不规则，髓鞘层次紊乱。束问可见增生的结缔组织。小腿三头肌纤维染色见Ａ、Ｃ组肌纤维粗大。细胞核数量较多。肌萎缩情况较Ｂ组明显好转，肌纤维横径Ａ、Ｃ组间差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），Ａ、Ｃ二组与Ｂ组差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５。表２）。

表２术后１２周大鼠患肢运动神经传导速度和小腿三头肌

肌纤维横径测量（ｉ±ｓ，ｎ＝１０）

组别＾组Ｂ组Ｃ组

肌纤维攒径（岬）

７．２３±０．４３５．５７±０．３４７．２１±０．３９

神经传导速度（∥ｓ）

２１．８６±１．３Ｉ１８．４７±１．２１２２．０２±１．３

万方数据

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讨

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理想的组织工程神经应具备以下条件引３：（１）无免疫原性；（２）具备接纳再生轴突长人，对轴突起机械引导作用的仿生结构；（３）支架具有良好通透性，有利于周围微环境营养物质的交换；（４）复合的种子细胞可在支架内存活、黏附、移行分化为ＳＣｓ；（５）通过移植体的轴突能成熟到正常直径、髓鞘化和传导动作电位；（６）可降解吸收，无毒副作用，构建方便，易于设计。本研究成功利用组织工程原理和方法，体外培养、扩增大鼠ＢＭＳＣｓ，观察其生长特性，并用ＢｒｄＵ进行标记，通过微注射法结合共同培养的方法，将ＢＭＳＣｓ与ＡＸＮ复合构建组织工程神经，修复大鼠１０ｍｍ的坐骨神经缺损，以评价其神经修复的效果及ＢＭＳＣｓ的转归。我们参照Ｈｕｄｓｏｎ等［９］９的方法，萃取与大鼠坐骨神经粗细相匹配的兔胫神经，去除其细胞及细胞成分，仅保留纤维及胶原构成的神经基膜管，组织学观察发现其所有细胞（包括ＳＣｓ、束膜细胞、成纤维细胞、血管的内皮细胞等）均已消失，因此ＡＸＮ是一种良好的具有仿真结构的神经替代材料。

移植免疫的核心问题是组织相容性复合体（ＭＨＣ），周围神经ＭＨＣ的表达产物主要存在于ＳＣｓ膜表面，构成了ＳＣｓ的膜抗原，是产生移植免疫的主要原因【１０Ｊ，而细胞外基质免疫原性是微弱的，可以忽略，化学萃取后的神经其免疫原性已基本消

失川，具有良好的生物相容性。在ＡＸＮ的制备过

程中，我们充分去除了细胞成分，这在组织学检测中已得到证实，流式细胞仪对新鲜神经和ＡＸ＿Ｎ进行ＭＨＣ．１１抗原的检测，结果显示ＡＸＮＭＨＣ—ＩＩ抗原明显减弱，术后４周大鼠坐骨神经连续性好，与周围组织轻度粘连，表面颜色同正常新鲜神经，管壁上见新生毛细血管分布于ＡＸＮ移植物，以保证再生轴突的血运，组织学观察未见有炎性细胞浸润，移植物内有大量神经束，外周血流式细胞仪ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８Ｔ细胞亚群检测结果显示三组间差异无统计学意义（Ｐ

＞Ｏ．０５）。

ＡＸＮ的主要成分是Ｌａｍｉｎｉｎ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、四型胶原等细胞外基质，具有促进细胞的黏附、迁移和再生轴突的生长，引导神经再生的作用。我们将体外培养的ＢＭＳＣｓ与∞（Ｎ复合２４ｈ，取组织固定切片，免疫荧光显微镜视下观察发现在波浪状纵行排列的纤维支架内散在有ＢｒｄＵ标记的活性ＢＭＳＣｓ（图３），证实ＢＭＳＣｓ可以在∞（Ｎ内黏附生长。万方数据

ＢＭＳＣｓ不仅具有较强的自我复制能力，而且具有多向分化潜能，在不同的诱导条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等［１２］，随着微环境的改变，ＢＭＳＣｓ的基因表达会发生改变，转化为内环境诱导的新生细胞。本实验进行了大鼠ＢＭＳＣｓ的原代培养和传代培养，生长曲线测定显示ＢＭＳＣｓ适应能力强，增殖速度快，体外扩增容易，并可用ＢｒｄＵ标记，我们在术后４周取材见只有Ａ组Ｓ—１００蛋白阳性细胞其细胞核内同时有ＢｒｄＵ阳性表达，初步证明了ＢＭＳＣｓ可在体内分化为ＳＣｓ。ＢＭＳＣｓ向ＳＯｓ的分化是干细胞本身的生物学特性和所处环境共同作用的结果，从分子水平来看，细胞分化的本质问题是基因表达调控，不同基因在不同时间和空间的开启和关闭及各种转录因子等。干细胞携带着决定ＳＣｓ表达的基因座，由于在甲基化的状态下，转录不能被激活，只有将基因座去甲基化，才能指导细胞的分化。植人体内的ＢＭＳＣｓ向ＳＣｓ的转化可能是周围神经损伤后，局部组织细胞（如ＳＯｓ等）或机体因刺激释放某些生物活性物质，通过组织问液，形成诱导干细胞分化微环境，这些物质被移植细胞摄取，诱导了ＢＭＳＣｓ向ＳＯｓ分化。至于诱导细胞分化的微环境分子学基础及细胞分化的基因表达调控，有待从分子生物学领域进一步研究。

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（收稿日ｊ蝈：２０１１—１２４３８）

（本文编辑：王涛）

?病例报告?

组织移植中受区无皮下浅静脉的处理长期随访一例

赵风林李宗宝王文德王鑫胡亮

患者男，”岁。１９９９年１１月因机器伤导致右前臂、手背皮肤及皮下组织自肘关节至手背逆行套状撕脱伤，深达肌膜层，伴有拇指和虎口区皮肤缺失，撕脱下的组织内含有皮下浅静脉、皮神经，挫伤污染重，无法通过血管吻合的方式修复。一期手术行清创术，将撕脱下的组织修剪成全厚皮片戳孔圆植．皮片成活后，留有拇指和虎口区皮肤缺损创面（图１）。于伤后１４ｄ行游离第二足趾加股前外侧皮瓣联合移植再造拇指和重建虎口术（图２）。血管、神经吻合方案：桡动脉近端与足背动脉吻合，远端与旋股外侧动脉降支吻合；一

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田１拇指和虎口区皮肤缺损刨面田２拇指再造和虎口区刨面修复术后田３术后１年随访手功能恢复情况田４术后１２年随访手功能恢复情况

条桡静脉与大隐静脉属支吻合，另一条桡静脉与旋股外侧动

脉降支的一条伴行静脉吻合。皮瓣动脉的另一伴行静脉与大隐静脉属支吻合；第二足趾固有神经与拇指尺侧固有神经缝合。皮瓣的神经与拇指桡侧固有神经缝合。按常规术式缝合

肌腱，术后２块组织瓣顺利存活。术后１年随访皮瓣略显臃

肿，不能对指（图３），指腹两点分辨觉为８咖，皮瓣两点分辨

觉为１０舢。术后１２年随访皮瓣外形良好，虎口开大满意，

第一腕掌关节旋转对指功能恢复好（图４），持物稳定．指腹两点分辨觉为５

脉管壁薄、口径小。这给手术增加了难度和风险，为此我们选择了与桡静脉口径相似的大隐静脉属支吻合，将皮瓣的血管蒂设计得较短，这样旋股外侧动脉降支的伴行静脉口径与桡静脉相似，并且２块组织瓣的动脉单独供血，静脉与桡静脉吻合后再进行并联吻合，这样如果一条静脉发生危象时，也有机会补救。术前大胆而周密的设计，术中精确的操作和高质量的血管吻合是手术成功的关键。

参考文献

［１］顾玉东．中国手外科２０世纪的回顾与２１世纪的展望．中华

创伤杂志。１９９８。１４：３４３．３４５．

ｍ．皮瓣两点分辨觉为８一。供足外形无

明显影响，行走正常，患者自感满意。

讨论组织瓣联合移植法再造拇、手指及修复手部缺损，已经作为常规手术应用于临床，且成活率与功能效果在不断地提高［１】，一般情况下受区都有较多可供选择的静脉血管。大多与皮下浅静脉吻接。每块组织瓣都有独立的动脉血

供和静脉回流［“，以免发生血管危象后出现连锁反应，导致

组织瓣坏死口Ｊ。

本例患者前臂皮肤及手背皮下组织呈套状撕脱且严重挫伤，制成全厚皮片回植后造成皮下浅静脉的缺失，二期再造拇指和重建虎口时。受区只有深静脉可供吻合，由于桡静

［２】芮永军．寿奎水，张全荣．等．四、五块游离组织组合移植

一期手再造．中华手外科杂志．２００３，１９：２２３－２２５．

［３］王文稿．李宗宝．王业本．等．多手指缺失的显微外科再

造．中华显徽外科杂志，２啷．２８：１９－２０．

ＤＯＩ：ＩＯ．３７６０／ｅｍ＆．ｊ．ｈ．１０晒－；【１５４Ｘ．２０１２．０２．０２１

作者单位：２５０１０１山东，济南市第三人民医院手、显微外科

（收稿日期：２０１Ｉ．ＩＩ．ｔ７）

（本文编辑：蔡佩琴）

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