植物脱毒新技术_低温疗法_陈芳

河南农业科学

植物脱毒新技术)))低温疗法

陈 芳,王子成

(河南大学农业生物技术研究所,河南开封475001)

摘要:植物病毒能影响植物的生长和发育,降低作物的产量和质量,对植物的危害十分严重。传统的植物病毒脱除方法如茎尖培养和热处理脱毒法对病毒的防治起到了重要的作用,由于传统的脱毒方法有技术操作困难、费时、脱毒率低等局限性,不能根治病毒的危害,致使病毒危害日益严重。近几年发展起来的低温疗法,不仅在保存植物种质方面有独特之处,而且操作简单,快速,脱毒率高,是植物病毒脱除的一种新技术。

关键词:植物病毒;脱毒;低温疗法

中图分类号:TB66 Q813.1+2 文献标识码:A 文章编号:10043268(2006)12001104 从第1个植物病毒)))烟草花叶病毒(Tobac-comosaicvirus)发现至今,植物病毒种类已达近千种。病毒侵染植物后,能破坏细胞的代谢活动,引起植物的病理变化,从而影响植物的生长和发育,降低作物的产量和质量,甚至使植物死亡。植物病毒在细胞内和细胞间的运动是造成病毒局部和系统侵染植物的主要原因之一。植物病毒分布广,繁殖快,防治难,有植物"癌症"之称[4]。随着生态环境的恶化和植物种质的不断引进,病毒种类还在不断增多,危害呈加重趋势。

据统计,全世界每年由植物病毒造成的经济损失约400亿美元。我国是个农业大国,植物病毒病发生较严重,损失巨大。调查发现,河南省每年因病毒病造成的经济损失达4亿元,很大程度上影响了农民的生产积极性和经济效益的提高。因此,加强对植物病毒的研究,寻找有效的防治措施,是当前和今后农业科技研究的一个重点和难点。

在植物病毒病害防治上,植物病毒脱毒技术得到了广泛的应用,并取得了良好的效果。目前,传统的植物病毒脱除方法主要有以下几种:热处理脱毒法、茎尖培养脱毒法、热处理结合茎尖培养脱毒法、化学疗法和基因工程技术脱毒法等。热处理脱毒法操作容易,但费时,脱毒不完全,植株存活率低。相对于热处理,茎尖培养脱毒法脱毒率较高,但需在解剖镜下切取0.1~0.5mm的茎尖,操作和培养困

[6,7]

[5]

[2,3]

[1]

难。热处理与茎尖培养相结合的脱毒法比单纯的热处理和茎尖培养的脱毒率和植株成活率高,是目前植物病毒防治较有效的方法。这种方法已应用在了许多植物上。化学疗法主要是抗植物病毒剂的应用,使用方便,操作简单,适于病毒的大面积防治。1984年Dawson等人虽提出了抗病毒剂的作用原理,但目前抗毒剂的作用机理还不完全清楚,高效的抗病毒剂仍缺乏,且一些化学药剂对环境能产生不利的影响[10]。基因工程技术脱毒的某些研究领域已取得了一些重大突破,转基因植物能表现出不同程度的抗、耐病性[11]。由于转基因植物的安全性问题及其他各种原因,转基因植物的推广还需时日。鉴于上述脱毒方法的局限性,这里主要介绍一种新的脱毒方法)))低温疗法(Cryotheraphy)。1 低温疗法的原理及操作技术

近年来,在植物超低温保存研究过程中发现经超低温保存处理后再生的植物材料,其含病毒量降低,大部分材料完全没有病毒,因此,低温疗法应运而生,已成功的用于几种植物病毒的脱除,并以其简单的操作方法和高脱毒率为植物病毒的脱除带来新的希望。1.1 低温疗法的原理

低温疗法是基于超低温保存(Cryopreserva-[15]

tion)对细胞的选择性破坏的原理,结合组织培养

[12~14]

[9]

[8]

收稿日期:20061011

作者简介:陈 芳(1975),女,河南开封人,在读硕士研究生,主要从事植物生物技术研究。

通讯作者:王子成(1974),男,河南邓州人,副教授,硕士生导师,博士,主要从事植物遗传学及生物技术研究。

E-mail:wzc@http://wendang.chazidian.com

2006年第12期

和病毒检测技术达到脱毒的目的。超低温保存是指在80e以下的超低温保存种质资源的一整套生物技术。常用的冷源有干冰(79e)、深冷冰箱、液氮(196e)及液氮蒸汽相(

140e)。现在常用液氮

做冷源。超低温保存的原理是在超低温条件下,细胞的全部代谢活动近乎完全停止,大大减慢甚至终止代谢和衰老过程,保持生物材料的稳定性,减少遗传变异的发生,达到长期保存的目的[16]。迄今,不同的植物材料如愈伤组织、胚轴、茎尖、花粉、根尖、休眠芽、茎段、悬浮细胞、原生质体等的超低温保存都有报道[17,18]。茎尖分生组织的分化程度小,在超低温保存后的再生过程中,比其他细胞培养物的遗传性稳定,是超低温保存的一种理想材料,具有独特的优越性。尤其对那些易产生体细胞无性系变异或营养繁殖的植物来说,茎尖分生组织超低温保存更是较理想的保存方案

[20]

[19]

液)处理一段时间,进一步降低组织的含水量,这样,可以避免渗透压的剧烈变化对材料的伤害。装载溶液(Loadingsolution)的组成一般是2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖[24],有的是稀释的玻璃化溶液[21]。

1.2.1.3 冰冻保护剂脱水 除一些对脱水极不敏感的材料外,几乎所有的植物材料都要经过冰冻保护剂的处理,以保证超低温保存后才能成活。常用的冰冻保护剂是PVS2溶液

[25]

[23]

:30%(w/v)甘油+

15%(w/v)乙二醇+15%(w/v)DMSO+0.4mol/L蔗糖的培养基。不同的材料用冰冻保护剂处理的时间也不同。在保证细胞充分脱水,防止保护剂的毒害和渗透压造成细胞损伤的原则上,冰冻前,一般将加入保护剂的材料先放入0e处理30min左右。1.2.1.4 冰冻 冰冻方法主要有慢冻、快冻、分步冰冻、干冻、玻璃化冰冻等

[17]

。自麝香石竹苗端的,可根据材料选择冰冻

超低温保存成功以来,至今已对近200种植物材料

进行了超低温保存[21]。

超低温保存与茎尖培养相结合是植物脱毒和保存茎尖的一种方法。含有病毒的顶端细胞的液泡较大,胞液中含有的水分也较多,在超低温保存过程中易被形成的冰晶破坏致死,而增殖速度较快的分生组织含的水分少,胞质浓,抗冻性强,不宜被冻死。光学显微镜观察显示,液氮中的超低温能杀死含较大液泡的细胞,而保存液泡小的顶端分生组织细胞。这样超低温处理过的植株再生后可能是无病毒的。

1.2 低温疗法的操作技术

结合超低温保存和目前报道的低温脱毒方法,对低温疗法的操作技术总结如下。

1.2.1 超低温保存过程

1.2.1.1植物材料的选择和预处理 要成功地进行超低温保存,植物材料的选择很重要,应选择最适生长阶段的材料。预处理方式和时间根据所用材料各异。对低温敏感的植物采用低温锻炼,通常将要保存的材料放0e左右的条件下处理一段时间。有些材料需在高浓度蔗糖(0.4mol/L)的培养基上预培养一段时间。有些材料不需要预处理。预处理的目的是使材料脱水、增加含糖量和提高细胞膜在严重脱水条件下的稳定性[22]。

1.2.1.2 装载(Loading) 为了减少冰冻保护剂的渗透压和毒性对抗脱水性较差的材料所造成的伤害,多数材料需要有一个装载的过程。即在室温条件下,材料用较高浓度的冰冻保护混合液(装载溶[12]

的方法。无论是那种方法,都是基于玻璃化理论[16]。无论是保存植物材料,还是去除植物病毒,玻璃化法都简单、快速、有效,是目前最常用的一种冰冻方法。玻璃化冰冻是将材料经较高浓度的冰冻保护剂处理后快速投入液氮,使材料迅速进入玻璃化状态,避免了对组织产生机械损伤的冰晶的形成

[26]

,能适用于多数材料。近年来新发展起来的包

埋)))玻璃化法(Encapsulation-virification)是将包埋-脱水和玻璃化法结合起来的一种方法[27],同时具有包埋-脱水法和玻璃化法的优点,且操作简便,材料存活率高,已经成功的保存了多种植物材料,具有较好的应用前景。

1.2.1.5 解冻及卸载 根据冷冻方法及材料来决定解冻的速度,一般采用快速解冻法:35~45e,1~3min。从热力学上讲,冰融化过程中再形成的冰晶尺寸较大时,对材料的伤害更大,要避免这种伤害,解冻速度应尽可能的快[28]。卸载的目的是清除细胞内的冰冻保护剂,即用洗液(一般为1.2mol/L蔗糖的培养基)洗涤3次,每次停留时间10~15min。高渗性的培养基有利于减轻细胞质壁分离恢复过程中造成的损伤[29]。

1.2.2 材料恢复生长和病毒检测 材料经过以上处理后,立即转移到相应的培养基中恢复生长。有些材料需要在黑暗条件下培养几天,再放到光照条件下培养。试验表明,培养在黑暗条件下的愈伤组织能较快的恢复生长,生长速度较快,存活率较高[30]。

对恢复生长的材料进行病毒检测是检验低温疗

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法脱毒成功与否的关键。常用的植物病毒的检测方法有生物学方法、血清学方法、电子显微镜检测法和分子生物学方法等。血清学检测方法快速、准确、灵敏度高、成本低,实际工作中应用较多。2 目前低温疗法的成功案例

迄今为止,关于低温疗法的报道很少,仅3例,国内还未见报道。1997年,BrisonM等人

[12]

[31]

用超

低温保存结合茎尖离体培养,成功的去除了李属根状茎上的李豆病毒,脱毒率达到50%,比单纯的茎尖培养的脱毒率20%多了近2倍,开创了低温疗法。随后,HelliotB等人[13]用低温疗法成功的去除了黄瓜花叶病毒(CMV)和香蕉条斑病毒(BSV),去除率分别为30%和90%。近来,WangQ等人

[14]

用包埋)玻璃化法成功的去除了葡萄病毒A(GVA),成功率高达97%,而单独的分生组织培养脱毒率仅为12%。3 展望

低温疗法脱除植物病毒不但避免了切取茎尖过程的操作困难,免除了在切取分生组织时由于时间过长和多酚的氧化而导致的茎尖黑化问题[13],而且脱毒率高,具有传统方法无可比拟的优点。研究表明,对茎尖进行超低温保存是脱除植物病毒的一种简单、快速而有效的方法

[12~14]

,是植物脱毒的一种

新途径。随着理论和技术的不断发展和完善,低温疗法在植物病毒防治方面将发挥重要作用。但这项技术的发展历史还很短,成功案例还很少,许多问题,如具体材料适用的低温处理方法、低温引起的遗传和表观遗传现象等,尚需进一步研究,尤其是对更多的植物材料在低温疗法上的脱毒效果将是今后研究的重点。

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(下转第81页)

河南农业科学

豫西珍果沙梨王及其栽培技术

杨建丽

(河南省农业科学院农业经济信息研究所,河南郑州450002)

中图分类号:S661.2 文献标识码:B 文章编号:10043268(2006)12008101 沙梨王,因其黄中透亮,形似芒果,又像腰鼓,故称/金珠果梨0,是洛宁县特有的地方性优良品种,属稀有名贵果品。由于沙梨王具有果形美观别致、风味独特、保健功能显著、成熟极晚、耐贮性强、早实丰产等特点,深受广大消费者青睐,在果品市场上具有较强的竞争力。加之独特的保健功能,被人们誉为梨中珍品。目前,沙梨王在洛宁县的种植面积已达

2

660余hm,年产量达2000万kg,产值2500万元。果品销售区域主要在洛阳、郑州等地,优质果供不应求。

1 沙梨王的生物学特性

沙梨王肉质酥脆细腻,汁液丰富,酸甜浓郁,蕴含山欧李、山楂、山樱桃等多种野生山果之独特清香,令人百食不厌。而且营养价值高,据测定,果肉中可溶性固形物含量高达17.6%,居众梨之首。并具有显著的润肺止咳、养颜排毒、软化血管、健脑益智、延缓衰老等保健功效。沙梨王极耐贮藏和运输,采收后在0~15e条件下可贮藏5个月,果皮有较强的韧性,容易长途运输。该梨速生丰产,头年种植,翌年结果,打破"桃三杏四梨五年"的常规。一般单果重150g左右,最大达350g以上。盛果期产量60000~75000kg/hm2,而且连年结果,可维持50年以上。2 栽培技术要点

2.1 苗木培育

沙梨王需嫁接育苗,砧木为棠梨,种子需层积处理。层积时间约2~3个月,用5倍左右的湿沙低温

藏至来年3月上中旬播种。一般采用条播,行距40~50cm,用种量15~30kg/hm2,定苗距离10~15cm。6月份以后开始嫁接,采用/丁0字形芽接法,接活后应及时解绑。注意加强肥水管理和病虫防治,培育优质壮苗。2.2 定植建园

选择土层深厚、土壤肥沃、质地良好、光照充足、有排灌条件、无环境污染的地方建园。山坡地应进行土地平整和土壤改良,定植时应挖大穴、施足肥、浇透水、封实土、盖好膜。定植密度,水肥地株行距4m@5m,旱坡地3m@4m。该品种自花结果能力较强,但栽植时亦应配置授粉树。2.3 整形修剪

密植时可采用自然纺锤形,干高50~60cm,树高3.5m,冠幅2.5~3m,剪留主枝12~15个,配置角度为70b~80b。稀植时可采用小冠疏层形,干高50cm,主枝5~7个,树高4~4.5m,冠幅3.5~4m。2.4 土肥水管理

以增施有机肥、磷钾肥、微量元素为主,幼树应适当控制氮肥和水分的供应,以利于控制生长,促进花芽形成。有机肥可在秋季施入,每公顷施有机肥45000~75000kg;追肥在萌芽期、花芽分化期(5月底)进行,每次每公顷施尿素75~150kg,磷肥375~750kg,钾肥37.5~75kg。2.5 虫害防治

主要有天牛、蚜虫、梨木虱等枝叶害虫和梨象甲、梨蝽、梨小食心虫等果实害虫。可用灭扫利、阿维虫清、大功臣等药剂进行有效防治。

收稿日期:20060712

作者简介:杨建丽(1960),女,河北安国人,副研究员,主要从事农业科研管理和技术推广工作。(上接第13页)

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