凡纳滨对虾覆膜养殖池塘沉积物微生物群落的磷脂脂肪酸谱图分析(1)

第35卷第12期2011年12月

水产学报

JOURNALOFFISHERIESOFCHINA

Vol．35，No．12

Dec．，2011

文章编号：1000－0615（2011）12－1865－08DOI：10．3724/SP．J．1231．2011．17560

凡纳滨对虾覆膜养殖池塘沉积物

微生物群落的磷脂脂肪酸谱图分析

11*21111

翟海佳，郑忠明，金中文，陆开宏，孙芳，汪洋，李越蜀

（1．宁波大学教育部应用海洋生物技术重点实验室，浙江宁波315211；

2．宁波市海洋与渔业研究院，浙江宁波315020）

摘要：于2010年7—10月，选择浙江省宁波市3个凡纳滨对虾覆膜养殖池塘进行水质、沉积

物理化因子的研究，并采用磷脂脂肪酸谱图（PLFA）法研究了沉积微生物在不同养殖阶段的群落结构变化及其与环境因子的相关性。结果表明，在整个凡纳滨对虾养殖期间，沉积物PLFAs组成以饱和脂肪酸、支链脂肪酸和单不饱和脂肪酸为主，多不饱和脂肪酸与环丙烷脂细菌生物量和真菌生物量伴随着养殖的进行都明显增加。肪酸含量较少。微生物总生物量、虽然沉积物微生物是以细菌为主体，但真菌更适应沉积物的环境，因此细菌与真菌的比值在不但在末期变化不明显。断降低。G细菌与G细菌的比值表现在养殖后期比中期有所下降，冗余分析（RDA）表明，微生物总生物量、细菌生物量和真菌生物量与总氮（TN）正相关性最为

G+细菌生物量和G－细菌生物量与NO－N、NO－N呈现显著的正相关，显著，这些微生物群落2-3-结构因子全部和透明度（SD）呈现显著负相关关系。

关键词：凡纳滨对虾；覆膜池塘；沉积物；微生物群落结构；磷脂脂肪酸谱图中图分类号：Q938．8；S967．4文献标志码：A池塘沉积物是指池塘水体范围内发生的物理、化学及生物学过程所产生的沉降物质，是养殖生态系统的重要组成部分。沉积物中的有机质一部分可以被底栖生物同化，还有很大一部分需要微生物的参与才能进行分解

［1］

+

－

菌、产H2S细菌和硫酸盐还原菌的数量变化进行监

［4］

测；申玉春等用血球板计数法对凡纳滨对虾

（Litopenaeusvannamei）高位池沉积中的细菌数量

［5］

的动态变化进行了研究；钱丽君等用传统平板稀

。因此，池塘中的

微生物数量种群组成上的微生物生态系统状况，

变动以及代谢分解有机物的能力对养殖环境有很大的影响

［2］

释法对三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）养殖

池塘泥样中的细菌进行分离纯化，并应用PCR-DGGE方法揭示各类群细菌的分类多样性；LEON等

［6］

。由于养殖生态系统的特殊性，池塘

对养殖池塘表层沉淀物中微生物的活动特点

营养、捕食等内微生物群落不仅受到环境中能源、

因素的影响还要受到各种有序的人类活动的干如人工投饵、增氧、调节pH等。因此，养殖环预，

境中微生物群落结构的变化应该呈现一定的规律性，反应当时养殖系统的健康状况。

有关养殖池塘沉积物中微生物的相关研究已贾俊涛等有较多报道，

［3］

进行了研究。但目前这些研究大都是建立在分离培养计数的基础之上，然而大部分环境微生物处于使得通过传统培养分离法了解存活不可培养状态，

环境微生物生物量与群落结构变化比较困难；另外气象特点不同，养殖品种不同，由于不同地域气候、

各地的养殖水域和池塘的生态系统有其显著的特

点，因此不同养殖池塘沉积物微生物生物量与群落结构之间的变化趋势往往不相同。

采用围隔实验生态学方

法，对对虾养殖池塘沉积物中的细菌总量、氨化细

收稿日期：20110602

修回日期：20110921

资助项目：国家科技支撑计划（2011BAD13B08）；宁波大学教研项目（JYXMxzh200913）E-mail：zhengzhongming@nbu．edu．cn通讯作者：郑忠明，

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近年来，磷脂脂肪酸（phospholipidfattyacid，PLFA）谱图分析技术已广泛应用于堆肥样品、湖泊沉积物和土壤微生物群落研究

［7－9］

PLFA是活体微生物细胞膜恒定组分，其对环境

因此特定菌群因素敏感且在生物体外迅速降解，

PLFA变化可反映出原位土壤细菌、真菌活体生物量与菌群结构等

［14］

［11－13］

，但应用于

养殖池塘沉积物种微生物群落结构分析还鲜有报

道。本研究通过现场调查，选择了新型养殖模式对其进行现场和下的凡纳滨对虾覆膜养殖池塘，

实验室的水质及沉积物理化因子检测、并引入PLFA法对沉积物中微生物群落结构不同时期的变化进行分析，通过主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）和冗余分析（redundancyanalysis，RDA）研究环境因子与沉积物微生物群旨在通过对新型养殖模式池塘落结构间的关系，

环境微生物生态的研究，比较准确地了解其生态状况，监测环境变化，并用来指导养殖生产。

。具体操作在WHITE

的方法上加以改进：（1）提取，称5g冷冻干

5mL氯加入4mL柠檬酸缓冲液，燥后的沉积物，

10mL甲醇［V（柠檬酸缓冲液）∶V（氯仿）∶V仿，

（甲醇）=0．8∶1．0∶2．0］，25℃避光震荡3h，3000r/min离心10min后取上清液。再加入5mL柠檬酸缓冲液和5mL氯仿（柠檬酸缓冲液∶氯仿∶甲醇=0．9∶1．0∶1．0），震荡1min，避光条件下保存18h。经18h静置分离后，吸走上层水相部分，保留底层氯仿相，在氮气下吹干氯仿。（2）分离，使用固相萃取装置分离PLFA，固相萃取小柱为SupelcoDiscoverySPEDSC-SiSilicatube．3mL．500mg（52654-u．packof54），先用10mL氯仿清

3mL氯仿分批溶解样品后注入硅胶柱洗小柱，

10mL丙酮、内，然后依次分别加入10mL氯仿、

10mL甲醇，收集甲醇相并在氮气下吹干。（3）甲脂化，向吹干样品中加入1mLV（甲醇）∶V（甲

手苯）（1∶1）和1mL0．2mol/LKOH甲醇溶液，动摇晃1min，放入水温34～36℃温浴15min，后

0．3mL1依次加入2mL去离子水，冷却到室温，

2mL正己烷，mol/LHAc，漩涡混合30s，然后

3000r/min离心10min，重复提取一次，合并两－20℃冷冻保氮气下吹干，次提取的正己烷相，

存。在进行GC测定前用加入C19∶0做为内标的正己烷（色谱纯）定溶。

GC条件：GC型号为Agilent6890；毛细管柱

5（30m×0．25mm×0．25μm）不分流进采用HP-样，进样口温度260℃，检测器温度260℃。

PLFAs定量根据外标标样，选用Supelco公司的BacterialAcidMethylEstersMix和478852-U内含37种脂肪酸甲酯（fattyacidmethylesters，FAMEs）混合标样，可涵盖沉积物PLFAs范围。

脂肪酸分子式以“X∶YωZ（c/t）”表示，其中“X”，“Y”代表脂肪酸分子的碳原子总数代表不，“ω”代表烯键距离羧基的位置，饱和烯键的数目

“Z”（iso）代为烯键或环丙烷链的位置。前缀“i”

表异构甲基支链（距甲基端的第二个碳原子），“a”（anteiso）代表前异构甲基支链（距甲基端的

“cy”第三个碳原子），代表环丙基支链，后缀“c”“t”和分别代表顺式和反式同分异构体。

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1

1．1

材料与方法

采样池塘

选择浙江省宁波市横山码头的3个理化条件

相同的高密度凡纳滨对虾养殖池塘，池底全部覆盖厚度为0．5mm的黑色聚乙烯塑料薄膜，每个

2池塘面积约3000m，养殖期间池塘水位为1．5～

1．8m。7月5日统一投放虾苗（0．8～1．0cm），

2

放养密度100ind/m。在养殖期间，前期（7月5

日—8月5日）不换水，中期（8月5日—9月5日）每半个月少量换水，后期（9月5日—9月25日）累积换水三分之一，末期（9月25日以后）因

不再换水。增氧方式为水表层铺设已开始捕捞，

管道和水车增氧两种方式结合。

1．2样品的采集和处理

于2010年7—10月，每10天采集3个覆膜凡纳滨对虾养殖池塘的中间和四周底层的水样，水样中氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐、总氮、总磷等指标

测定方法用HACH（DR/2800）水质检测仪检测，

［10］

《海洋调查规范》按照进行。现场利用美国产

的HACH（Quanta）水质检测仪，检测池塘底部（沉积物与水界面接触处）溶解氧、温度、盐度、pH，并用透明度盘测定水体透明度。同时分别在养殖的中期、后期、末期3个时期分别采集覆膜池底稠状沉积物于灭菌的样品瓶中，然后放入4℃泡沫塑料冷藏箱中保存，并在采样后的4h内进行冷冻干燥处理。1．3

微生物群落分析方法

用PLFA法测定沉积物微生物群落结构，

12期翟海佳，等：凡纳滨对虾覆膜养殖池塘沉积物微生物群落的磷脂脂肪酸谱图分析1867

特征脂肪酸是不同微生物类群的生物标志

［15－17］

，15物，根据现有的研究成果本研究以14∶0，∶0，16∶0，17∶0，i15∶0，a15∶0，il6∶0，16∶1ω9，il7∶0，

cyl7∶0作为细菌源脂肪酸；真菌源脂肪酸以18∶1ω9c+t，18∶2ω6c+t，18∶3ω3表示；革兰氏阳性菌（G+）以il5∶0，al5∶0，il6∶0和il7∶0表示，革兰氏

－

阴性菌（G）以cy17∶0表示。1．4数据分析

增高的趋势，但大体波动范围为8．24～9．92，平均为9．20，为碱性水体；溶解氧因使用了两种不同的增氧方式，且进行了定时增氧，因此波动不是太大，基本维持在5～9mg/L；池塘透明度变化在0．25～1．20m，平均为0．55m，水体透明度前期较高，但随养殖时间的延长，中后期水中有机碎屑和无机悬浮物的数量，以及水中浮游植物、浮游动物的种类和数量的大幅增加而显著下降（表1）。养殖试验期内3个池塘的水体营养盐呈现了明显的变化，主要表现在总氮随着养殖的进行一直呈现上升的趋势；亚硝酸盐和硝酸盐在养殖前期和但到了后期都发生中期保持了一个很低的水平，

了急速的提升。氨氮在整个养殖期间则经历了从一个低水平到一个高水平后又迅速回落的过程；总磷在养殖前期到中期这个阶段呈现上升趋势，并在中期达到了最高值，但伴随着养殖的继续进行而又迅速回落，最后在养殖的末期再次升高（表1）。

数据采用主成分分析及冗余分析等数学统计

方法，分析软件为ORIGIN8、SPSS18．0、CANOCOforwindows4．5。

2

2．1

结果

池塘水质环境和营养盐变化

3个池塘的水质变化保持在整个调查期间，

了良好的一致性。其中水温大致相近（28．47～

32．43℃），没有发生较大的起伏；盐度在整个养殖过程中有下降趋势，尤其在后期更为明显，整个过程的平均盐度为25．19；pH随着养殖的进行有

Tab．1

日期date07-0607-1507-2508-0508-1508-2509-0509-1509-25

水温/℃WT28．47±0．6130．05±0．2229．40±0．3930．65±0．4630．88±1．3230．93±0．8429．68±0．1232．43±0．1729．92±0．19

pH8．47±0．178．44±0．299．25±0．089．49±0．349．37±0．249．36±0．189．52±0．379．24±0．309．38±0．05

表1实验池塘各项水质指标

Themainwaterqualityindicatorsoftheexperimentalponds

盐度S27．86±0．4726．23±2．6426．69±3．6028．13±3．2128．50±2．4926．27±1．0026．79±3．0323．98±2．0320．03±0．86

溶氧/（mg/L）DO8．26±0．136．31±0．795．81±0．746．22±1．997．18±0．746．14±0．856．47±1．137．92±0．778．46±0．77

透明度/mSD1．17±0．030．97±0．030．78±0．060．67±0．030．60±0．050．53±0．030．43±0．030．35±0．000．27±0．03

氨氮/（mg/L）NH+N4-0．060±0．010

a

mean±SD

总氮/

（mg/L）TN1．700±0．458

a

硝氮/（mg/L）NO－N3-0．233±0．057

a

亚硝氮/

（mg/L）NO－N2-0．010±0．004

a

总磷/

（mg/L）TP0．380±0．095a0．527±0．065a0．593±0．049ab0．670±0．070ab1．150±0．248c1．000±0．200c0．400±0．173a0．287±0．045a0．866±0．335bc

0．140±0．122a0．073±0．023

a

0．367±0．115a0．267±0．058

a

0．028±0．022a0．004±0．002

a

2．667±0．416b1．467±0．153

a

0．080±0．056a0．243±0．172

a

1．300±0．385b1．467±0．153

b

0．003±0．001a0．004±0．003

a

1．933±0．551ab2．767±1．305

b

0．313±0．205a1．643±0．3300．6560．205

b

1．400±0．60b0．700±0．200

ab

0．008±0．005a0．103±0．031

ab

5．867±0．666c5．567±1．3650．9290．961

c

1．700±

b

1．467±0．8331．401

b

0．428±0．1450．006

c

6．667±

c

0．520±

a

6．867±

c

0．579±

d

8．767±

d

注：表中同一列标有不同字母的平均数表示差异显著（P＜0．05）。

Notes：Meanswithdifferentsuperscriptsinthesamecolumnofchartaresignificantlydifferent（P＜0．05）．

2．2沉积物微生物群落结构分析

沉积物磷酯脂肪酸组成及相对含量在养

3个不同的池塘总共检测到PLFA殖的不同时期，

种类从C14到C20共计21种。其中，饱和脂肪

15∶0、16∶0、17∶0和18∶0这5种，酸包括14∶0、其相对含量为42．61%～65．24%，是沉积物中含量

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1868

水产学报35卷

最丰富的脂肪酸种类，其次是支链脂肪酸i15∶0、a15∶0、i16∶0、il7∶0和单不饱和脂肪酸14∶1、15∶1、17∶1、18∶1ω9c、18∶lω9t、16∶lω9、20∶1相对含量分别为6．24%～l0．31%和15．23%～21．49%。多不饱和脂肪酸18∶2ω6c、18∶2ω6t、18∶3ω3、20∶3ω3的相对含量较低，仅占总PLFA的2．77%～6．11%，而环丙基脂肪酸cy17∶0的相对含量最低，不到总磷酯脂肪酸（PLFA）的2%。

特征性脂肪酸的主成分分析（PCA）将不同时期能指示不同微生物群落类型的特征性脂肪酸进行主成分分析（图1），结果显示：PC1和PC2两个主成分占沉积物微生物群落结构组成的81．4%。除i16∶0外，其他特征脂肪酸远离原点，说明在养殖过程中脂肪酸的含量发生了明显变化。

a15∶0、16∶1w9、cy17∶0、18∶0、18∶1ω9c+其中14∶0、

t、18∶2ω6c+t和18∶3ω3在PC1上的载荷值较高，主成分一是它们的代表因子。其中的不饱和脂肪肪

cy17∶0是革兰酸是指示真菌的特征脂肪酸脂肪酸，

－－

氏阴性菌（G）的特征脂肪酸，说明了真菌和G在

i16∶0、i17∶0养殖过程中发生了明显的变化。i15∶0、

生物量变化。如图2所示，在整个凡纳滨对虾养

3个实验塘沉积物中的微生物量殖的不同时期，

有显著变化，主要表现在PLFA总量（TPLFA）随

着凡纳滨对虾养殖的延长皆呈递增的趋势，后期的TPLFA为养殖中期的1．5～1．7倍，到了末期TPLFA已达到中期的1．8～2．2倍。同时通过对各类型微生物特征性PLFA的统计分析，细菌和

+

真菌的生物量（BPLFA和FPLFA）以及GPLFA

－

和GPLFA也是随着养殖时间的延长而逐渐增加的，这和上述计算的微生物总生物量的变化趋势

相同。但通过对比不同养殖时期的BPLFA和FPLFA后发现，在养殖的整个周期内，虽然沉积物中微生物是以细菌为主体的群落结构，但BPLFA与FPLFA的比值（B∶F）由养殖中期的（6．60±0．78）降到后期的（5．63±0．49）再到末期的（4．73±0．23）。这说明了随着养殖的进行，细菌生物量在整个微生物群落中的比重在不断降低，养殖过程中池底沉积物底质理化特性的改变

+－

更适应于真菌的生长繁殖。GPLFA与GPLFA的比值在中期约为（2．15±0．16），到了后期已经降到（1．47±0．19）。但在末期时并没有发生明显+－

变化，大体为（1．46±0．11）。说明G和G细菌在养殖池塘后期到末期这段时间里，结构比例已经

在PC1上的载荷值相对较低，它们是革兰氏阳性菌

（G+）的特征性脂肪酸，说明养殖过程沉积物中的G+变化相对不明显

。

趋于稳定，不再随环境变化而变化

。

图2

Fig．2

图1

PCA分析显示特征脂肪酸随养殖时间的变化分布

PCAofcharacteristicfattyacidprofilesofsamplesindifferentcultureperiod

Fig．1

不同养殖时期沉积物微生物群落结构变化（平均值±标准差）

Variationofmicrobialcommunitystructureinthe

sedimentsofdifferentaquacultureperiods（mean±SD）

2．4

2．3

微生物总PLFA（生物量）及群落结构变化

有研究发现用总PLFA指示的生物量与用熏。因此本试验用总PLFA指示总微生物

沉积物微生物群落结构与环境因子关系的冗余分析（RDA）

通过选取总PLFA（TPLFA）、细菌PLFA（BPLFA）、G+细菌PLFA真菌PLFA（FPLFA）、（G+PLFA）、G－细菌PLFA（G－PLFA）、细菌PLFA

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蒸技术提取计算的微生物生物量有很好的相关性

［18－19］

12期翟海佳，等：凡纳滨对虾覆膜养殖池塘沉积物微生物群落的磷脂脂肪酸谱图分析1869

∶真菌PLFA（B∶F）和G+细菌PLFA∶G－细菌

PLFA（G+∶G－）7个因子作为可能的群落分析指

pH、TN、标和DO、温度、盐度、透明度以及TP、NH+N、NO－N、NO－N等环境因子，对它们进行4-3-2-冗余分析（RDA），考察各不同微生物群落因子与环境因子变量之间的关系，以及各群落因子对微

生物群落结构随外界条件变化的表征程度。冗余分析使用CANOCOForwindows4．5（图3）

。

子一样，但是相关性明显较弱。

3讨论

集约化养殖池塘是受人类活动直接影响的生

态系统，系统内群落生物量高、有机负荷大，各种理化因子、生物因子关系十分复杂，并且处于不断变化之中

［20］

。在本实验中，3个新养殖模式下的

凡纳滨对虾覆膜养殖池塘，因池底全部覆膜，阻断

因此随着养殖时间的了底泥与池水的物质交换，

增加，由于大量残饵、排泄物和尸体等在池底沉积

和腐败，高温下，水体中营养盐等浓度在养殖后期3个池塘属于标准化养殖池塘，增加迅速。同时，因此在养殖过程中，各种理化因子表现出相当的一致。

微生物、水生动物、外界环境、人工操作都影

而微生物在环境响养殖系统理化因子动态变化，

中理化因子的动态变化中具有决定性的作用

［21］

图3微生物群落结构因子与水质指标的冗余分析

坐标轴上数值表示因子的重要程度，箭头号延伸至该图边缘与其它因子具相关性。的因子表示其变化显著，

。

Fig．3Redundancyanalysisresultofsedimentsmicrobial

微生物是各种有机物质的分解者和转化者，能直

接利用动、植物生命活动过程中和死后分解形成生物大分子等。在分解过程中释放的各类碎屑、

营养盐为浮游微藻大量繁殖提供所需的养分，而

+

N、NO－N、NO－N以浮游微藻对水体中的NH4-3-2-及pH、溶解氧的变动有重要的影响，所以养殖系

communitystructurevariablesandwaterqualityindexes

Thevalueofacoordinateaxisindicatesthefactorisimportant，thearrowextendsthischartedge，indicatedthatitschangeisremarkable，hastherelevancewithotherfactors．

TPLFA、BPLFA和FPLFA3个因子与总氮

（TN）正相关性最为显著，与透明度（SD）则呈显著负相关性。B∶F本身和BPLFA和FPLFA有着

因此可以通过这两个因较好的负相关性（图3），

+－－

N、子进行表征。GPLFA和GPLFA与NO2-

统中的理化因子的动态变化与微生物具有显著的关系

［22］

。从本研究结果来看，覆膜池塘的特殊环

境状况，使池底沉积物随着养殖的进行而产生。

由于凡纳滨对虾迅速成长，水体中的浮游植物和浮游动物也大量繁殖，养殖废物（如未被食用的

对虾的排泄物以及衰老死亡的浮游生物）饵料，

以固态营养物或溶解态营养物的形式沉积于水

P以及其他营养物的含量底，同时池塘底质中N、因而附着于其中的各类沉积物微生物大量增加，

也伴随着其所需养分的增加而迅速增加。细菌∶真菌的比值（B∶F）可反映细菌和真菌含量的变化范围和两个种群的相对丰富程度

［23］

NO－N呈现显著正相关，同时与SD的显著负相3-+－+－

关性最高。G∶G本身和GPLFA和GPLFA有着很好的负相关性，因此可以通过它们进行表征。

BPLFA、TPLFA和FPLFA3个因子还与NO－N2-－

N和NH+N的正相有显著正相关关系，与NO3-4-－

关关系稍弱，与S呈现一定的负相关性。GPLFA、G+PLFA与TN存在着显著正相关，与NH+N则正相关性不显著。另外，因为在养殖期4-

，对比

pH、DO变化不明显，间T、而TP发生了较大的波动，因此4个可能的群落结构因子都没能很好地表征它们的变化（图3）。综上可知，在本实验分

TPLFA、BPLFA、FPLFA、G+PLFA和G－析中，

PLFA5个因子能够较好地反映微生物群落结构

B∶F和G+∶G－两个因子与环对环境因子的应答，

境营养要素相关性的主要特点虽然与其它5个因

不同养殖时期的特征性脂肪酸后可发现，覆膜池

塘沉积物中的B∶F比值逐渐降低，表明在养殖的后期，真菌的繁殖速度更快，更适应覆膜池塘的沉积物环境。THIET等

［24］

［25］

和VRIES等分别报

道了B∶F比值低的微生物群落可驱动土壤内源

碳底物进一步矿化，因而可以表明土壤生态系统的稳定性。因此，养殖池塘沉积物B∶F比值的逐

也暗示随着养殖的进行，后期的沉积物生渐降低，

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