一株抗菌活性物质产生细菌的分离及鉴定

摘要：从根际土壤分离到一株细菌CY04，通过电镜观察和16S rDNA 序列分析，发现该菌株同已知菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的相似度最高，为99%， 初步认定为枯草芽孢杆菌。抑菌试验结果表明，该菌株对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有一定的抑菌活性，对大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌没有抑菌活性。培养48 h左右是其产生抗菌活性物质的最佳时期。

关键词：根际土壤;枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;鉴定;抑菌活性

Isolation and Identification of One Strain Producing Antimicrobial Active Substance

YIN Jie，WANG MENG，ZENG Xiao-bo，MA Zhi-yong，CHENG Guo-jun

（College of Life Science， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074， China）

Abstract：A bacterium strain， designated as CY04， was isolated from the rhizosphere soil. The strain CY04 had the highest sequence identity with Bacillus subtilis （99%）. Based on morphological characteristics and analysis of the 16S rDNA sequence， the strain CY04 was identified as Bacillus subtilis. The antagonistic effects showed that CY04 had antimicrobial activity on Staphylococcus aureus， but had little inhibition on Escherichia coli and Bacillus subtilis. The optimal time for the resistant bacteria to produce antimicrobial active substance was 48h after cultivation.

Key words： rhizosphere soil;Bacillus subtilis;identification;antimicrobial activity

目前已知枯草芽孢杆菌可以产生多种抗菌物质，包括细菌素、脂肽类抗生素以及酶类、蛋白类抑菌物质等[3]。从枯草芽孢杆菌中分离的Fengycin能够抑制多种重要植物病原真菌的生长[4]。本研究从根际土壤样品中分离到一株能产生抗菌物质的细菌CY04，并根据形态学特征和16S rDNA基因序列对其进行了鉴定，初步认定其为枯草芽孢杆菌，同时对它的拮抗情况及产生原因进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 抗菌活性物质产生菌种的筛选

在LB平板上观察菌落形态，利用革兰氏染色法在油镜下观察菌体形态。将菌株用戊二醛固定，PBS洗涤和梯度乙醇脱水，真空冷冻干燥机干燥，扫描电镜观察、拍照。电镜放大倍数15 000。

1.3 CY04细菌16S rDNA基因序列测定和系统进化分析

以大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌为指示菌，采用牛津杯（内径6 mm，外径8 mm）法测定菌株CY04对不同指示菌拮抗能力[7]。取已活化的指示菌菌液接入牛肉膏蛋白胨液体培养基，37 ℃、20 r/min培养24 h。倒牛肉膏蛋白胨平板，在每个平板的中央置一个已灭菌的牛津杯，吸取指示菌菌悬液在平板上均匀涂布，待平板晾干后进行抑菌试验。将CY04菌株培养液离心，取上清液加入到牛津杯中，37 ℃恒温培养箱中培养48 h，观察生长情况并测量抑菌圈直径。

将活化后的菌株CY04按2%的接种量接入牛肉膏蛋白胨培养液中，每隔6 h取菌液离心，将上清液加入到牛津杯中，测定其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径，确定产生活性物质的最佳时期。

1.5 菌株CY04的抗性测定

以抗生素卡那霉素（Km）、氨苄青霉素（Ap）、链霉素（Str）、四环素（Tc）、庆大霉素（Gm）、氯霉素（Cm）、壮观霉素（Spe）为抗生活性物质，测定菌株CY04对抗生活性物质的抗性。将菌株CY04接种到LB培养液中，37 ℃摇床培养过夜。按2%的接种量将菌株接种于含不同浓度抗生素的LB液体培养基中，37 ℃摇床（200 r/min）振荡培养48 h，测定含各种不同浓度抗生活性物质菌液的吸光度，分析菌株CY04生长情况。

2 结果与分析

2.1 菌株CY04筛选及形态观察

进行细菌单株分离、筛选试验发现菌株CY04对金黄色葡萄球菌有较强的拮抗作用。菌株CY04革兰氏染色为阳性，产芽孢，其形态特征见图1。细菌大小为0.3～0.5 μm×1.5～3.0 μm。

2.2 菌株CY04的16S rDNA测序结果

以菌株CY04的DNA为模板进行扩增，获得1.5 kb左右的特异性片段，将测序结果和GenBank已登录的序列进行同源性比对，发现与Bacillus中多个种的序列具有高度同源性;与Bacillus subtilis同源性最高，达到99%。

2.3 菌株CY04的系统进化树

2.3 菌株CY04的抑菌活性

2.4 菌株CY04代谢活性物质产生时期的测定

每隔6 h取样进行抑菌圈测定发现，培养48 h左右培养液产生的抑菌圈最大，进而可以推断菌株CY04在48 h左右产生的活性物质最多，其产生活性物质的时间在其生长稳定后期，这与已有的报道一致[1]。

2.5 菌株CY04的抗性

3 小结与讨论

微生物杀菌剂具有高效、无污染、不易产生抗药性等特点，因而有广阔的应用前景。枯草芽孢杆菌产生抗菌活性物质已有相关报道[8-10]。本研究从根际土壤中分离到的细菌菌株CY04根据形态学特征以及16S rDNA序列比较鉴定为枯草芽孢杆菌。菌株CY04对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌没有抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑制作用较明显，说明CY04产生的抗生活性物质具有选择性毒力。进一步研究发现，CY04对除壮观霉素外的其他几种抗生素的抗性均较低，表明CY04菌株产生抗菌物质，是其能够在环境中生存的有效防卫机制。

参考文献

[2] STEIN T. Bacillus subtilis antibiotics： Structures， synthesesand specific functions[J]. Mol Microbiol， 2005，56（4）： 845-857.

[5] SAMBROOK J， FRITSCH EF， MANIATIS T. Molecular Cloning： A Laboratory Manual[M]. 2nd editon. New York： Cold Spring Harbor Laboratory，1989.

[6] KUMAR S， TAMURA K， NEI M. MEGA3： Integrated software formolecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J]. Briefings in Bioinformatics， 2004，5（2）：150-163.

[7] 刘冬梅，李 理，杨晓泉，等.用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力[J].食品研究与开发，2006，27（3）：110-111.

[8] 刘 静，王 军，姚建铭，等.枯草芽孢杆菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分离纯化[J].微生物学报，2004，44（4）：511-513.

[9] 崔堂兵，刘煜平，郭 勇，等.枯草芽孢杆菌培养生产农用抗真菌素初步研究[J].广东农业科学，2007（1）：51-54.