斑马鱼SAA蛋白原核表达、抗体制备及菌结合试验

4.江西中医药大学生物化学教研室，南昌 330004）

关键词：斑马鱼（Danio rerio）;血清淀粉样蛋白A;原核表达;抗体制备;菌结合

Prokaryotic Expression， Antibody Preparation and Bacteria Combining of

SAA Protein in Zebrafish

4.Department of Biochemistry Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China）

Key words： zebrafish（Danio rerio）; SAA; prokaryotic expression; antibody preparation; bacteria combining

1 材料与方法

1.1 试验材料

使用Primer premier 5.0软件设计上、下游引物，以pGEM-T-SAA为模板进行PCR扩增，其中上游引物序列：5′-TTTGAATTCATGAAGCTTCTTCTTG -3′，下游引物序列：5′-TTTTCTAGATATGGGCAGG

1.4 斑马鱼SAA蛋白的菌结合试验

将获得的斑马鱼SAA纯化蛋白用于细菌结合试验，具体操作见文献[10]。

1.5 斑马鱼SAA蛋白抗鼠血清制备

取100 μg纯化的斑马鱼SAA融合蛋白进行SDS-PAGE，切下目的蛋白质条带，以去离子水反复漂洗，去除凝胶上的甲醇和冰醋酸，以pH 7.4的PBS缓冲液4 ℃浸泡过夜。于冰浴中用研钵研磨直至悬浮液中的凝胶颗粒细小而均匀，加入等体积的弗氏佐剂，继续研磨或用注射器反复抽打使完全乳化。将1 mL用弗氏完全佐剂乳化的抗原溶液通过腹腔注射接种发育良好的纯种Balb/c小鼠体内做为基础免疫，基础免疫后14 d进行加强免疫。注射间隔周期为7 d，加强注射所用的抗原溶液用弗氏不完全佐剂进行乳化。加强免疫4次后采用传统摘除眼球取血法采集Blab/c小鼠血液。取出的血液37 ℃保温1 h后，4 ℃静置过夜，5 000 r/min离心10 min后，取上清-80 ℃分装保存。

1.6 斑马鱼SAA蛋白抗鼠血清效价的测定

2 结果与分析

2.2 SAA蛋白的表达与纯化

2.3 斑马鱼SAA蛋白菌结合试验结果

2.4 斑马鱼SAA抗小鼠多克隆抗体效价的测定结果

3 小结与讨论

斑马鱼SAA蛋白具有广谱的菌结合能力，对本试验所选取的5种细菌均表现出很强的吸附能力。哺乳动物SAA蛋白一般只能对革兰氏阴性菌有结合能力，对革兰氏阳性菌无结合能力。哺乳动物的免疫系统比鱼类复杂得多，对不同种类的细菌表现出不同的免疫机制。斑马鱼属于进化地位较低等脊椎动物，SAA蛋白可能担负起对整个细菌的识别，而在哺乳动物中，SAA蛋白功能可能被弱化和部分分离，进化压力胁迫对SAA蛋白功能产生了较大的影响。

参考文献：

[2] CIGNI A， LEDDA F， SATTA A E. A complex case of renal amyloidosis with a rare co-occurrence of 2 mutations in separate hereditary periodic fever syndrome-related genes[J]. J Nephrol，2006，19： 543-549. [3] ROSENTHAL C J， SULLIVAN L E.Serum amyloid A to monitor cancer dissemination[J]. Ann Intern Med， 1979，91： 383-390.

[5] YOKOI K， SHIH L C， KOBAYASHI R， et al.Serum amyloid A as a tumor marker in sera of nude mice with orthotopic human pancreatic cancer and in plasma of patients with pancreatic cancer[J]. Int J Oncol， 2005，27： 1361-1369.

[6] LIU D H， WANG X M， ZHANG L J. Serum amyloid A protein： A potential biomarker correlated with clinical stage of lung cancer[J]. Biomed Environ Sci， 2007，20： 33-40.

[7] KOVACEVIC A， HAMMER A， SUNDL M，et al. Expression of serum amyloid A transcripts in human trophoblast and fetal-derived trophoblast-like choriocarcinoma cells[J]. FEBS Lett，2006，580： 161-167.

[8] MULLAN R H， BRESNIHAN B， GOLDEN-MASON L， et al. Acute-phase serum amyloid A stimulation of angiogenesis， leukocyte recruitment， and matrix degradation in rheumatoid arthritis through an NF-κB-Dependent signal transduction pathway[J]. Arthritis Rheum，2006，54（1）： 105-114.

[9] 齐 麟，向志明，张 彤.斑马鱼SAA基因克隆及表达分析[J]. 河南师范大学学报（自然科学版），2011，39（5）：134-136.