稳定表达Syncytin的EL4细胞系的建立及鉴定

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翻新时间：2023-02-04

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稳定表达Syncytin的EL4细胞系的建立及鉴定

摘要：Syncytin是人类内源性逆转录病毒W家族的囊膜蛋白。近期研究发现Syncytin与白血病密切相关。为研究Syncytin的生物学功能，我们克隆了人syncytin，并连接到pIRES2-EGFP质粒上，转化该质粒至感受态大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆进行PCR、酶切电泳和DNA测序鉴定，成功构建了表达syncytin基因的真核表达载体。利用罗氏转染试剂转染重组质粒至EL4细胞，并通过G418选择性培养基筛选，在荧光显微镜下观察细胞中Syncytin表达，用RT-PCR、Western blot检测Syncytin表达水平，结果显示我们成功构建了稳定表达人Syncytin的ELA细胞系。稳定表达人Syncytin的EL4细胞系的建立，为进一步研究人Syncytin功能及其与白血病免疫逃逸的关系提供了重要的细胞模型和实验基础。

关键词：Syncytin蛋白；pIRES2-EGFP质粒；真核表达载体；EL4细胞；白血病

中图分类号：Q786

文献标识码：A

Syncytin的373-397残基是一个具有免疫抑制活性的多肽[9]，其在细胞表面的大量表达有利于癌变细胞逃避免疫打击，同时其具有的融合活性有利于细胞的迁移[10]。本研究拟构建syncytin，真核表达载体，并通过罗氏转染试剂转染小鼠淋巴瘤细胞细胞株（EL4），并通过G418抗性培养基筛选出稳定表达Syncytin的细胞系，通过RT-PCR和Western blot分别从mRNA与蛋白水平验证syncytin在EL4细胞中的表达情况。稳定表达syncytin基因的EL4细胞系的建立为进一步探讨syncytin基因异常表达对白血病免疫逃逸的机制提供细胞模型和实验基础。

1材料和方法

1.1材料

1.3.1EL4细胞的培养和质粒转染

1.4RT-PCR检测syncytin转录水平的表达

1.5Western印记检测细胞中Syncytin蛋白的表达

2结果与分析

2.1syncytin基因ORF的扩增

2.2重组质粒的鉴定

2.3稳定表达Syncytin的EL4细胞系的鉴定

在EL4-Syncytin细胞中，可清楚地观察到荧光蛋白（图3A、B、C、D），表明所构建的重组synctin载体已在EL4细胞表达。

2.3.2RT-PCR检测syncytin，基因的表达

提取EL4-Syncytin细胞和空载体转染细胞总RNA，以小鼠GAPDH基因为内参，运用qRT-PCR对syncytin进行相对定量。每个实验组两个复孔，实验重复3次。通过各组样品Ct值，利用2-△△Ct法计算得出EL4-Syncytin组为空载体对照组的120倍，表明syncytin在EL4细胞稳定高表达。实验结果见图4（A、B、C、D）。

2.3.3Western印记检测人Syncytin表达

EL4-Syncytin细胞和空载体质粒稳定转染细胞所提总蛋白经Western印记检测，内参显影条带亮度一致，EL4-Syncytin组条带亮度明显高于对照组，通过灰度值计算软件处理计算出实验组与对照组数据（见图5、6），EL4-Syncytin组蛋白表达水平明显高于空载体组蛋白表达水平，表明Syncytin在EL4细胞稳定表达且高表达。

3讨论

参考文献（ References）：

[2]LOWER S，LOWER J，KURTH R.The viruses in all of us：characteristics and biological significance of human endogenous retrovirus sequences[J]. Proceedings of the National Acade-my of Sciences， 1996， 93（11）：5177-5184.

[5]LARSSON L.HOLCK S，CHRISTENSEN J Prognostic role ofsyncytin expression in breast cancer[J]. Human Pathology， 2007，38（5）：726-731.

[9]Ml S，LEE X，LI X，et al.Syncytin is a captive retroviral en-velope protein involved in human placental morphogenesis[J].Nature， 2000， 403（6771）：785-789.