翻新时间:2022-10-24
谈DHPLC技术在基因突变检测上的应用
摘要:DHPLC用来检测DNA突变和单核酸多态性,可以取代传统分子生物学技术,不需要制备凝胶,检测DNA片段做到了全自动、高效、快速、准确,在疾病相关基因突变检测方面提供了有效的技术手段,是一种快速有效的基因突变筛查方法。
关键词:DHPLC技术;基因突变;检测
1 DttPLC技术原理
变性高效液相色谱(DHPLC)是一种高通量、自动化的基因突变检测技术。该技术已在医学、癌症、药物等研究领域开展应用,与SSCP和DNA直接测序等突变检测技术相比,DHPLC具有灵敏性更高,特异性更强,廉价省时等优点。
DHPLC技术的原理是基于未解链的和部分解链的双链DNA在部分失活条件下具有不同保留的性质。这种部分失活条件可以采取升高温度的手段获得。所有基因组DNA的单拷贝均可通过PCR反应大量扩增,杂合子个体的DNA经扩增产生异源双链,由于错配位点的氢键被破坏,因此在异源双链上形成“鼓泡”,导致它与纯合子个体的DNA扩增产物——完全匹配的同源双链的解链特征不同。在部分加热变性的条件下,异源双链DNA分子更易于解链形成Y形结构,与固定相的结合能力降低。当流动相中乙腈浓度梯度增大时,异源双链将先于同源双链被洗脱出来,带有突变序列的样品呈现出异源双链和同源双链混合物的峰形特点,而不含突变序列的样品则只有同源双链的峰形。据此可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段,从而提供有无突变的信息。
2 DHPLC技术在突变基因诊断中的应用
基因突变是指基因组DNA分子在结构功能上发生碱基对组成或排列顺序的改变,主要包括碱基的替换和小片段的缺失或插入,它是导致基因型疾病的重要原因之一。基因突变在生物医学研究中,尤其是在基因型疾病诊断及病理研究中有着非常重要的作用。随着人类基因组整体测序计划的发展,探索基因突变的任务变得十分迫切。
随着人类基因组整体测序计划的发展,探索基因突变的任务变得十分迫切。DHPLC技术自最早被用于分析人Y染色体单核苷酸多态性位点(SNP)以进行人种进化的遗传性研究;此后还用于筛查致病基因突变位点、分析单核背酸多态性以及基因启动子CpG岛甲基化修饰改变等研究;因其灵敏性及准确度均较高,操作实现了半自动化,检测周期短、费用低,尤其适合于基因结构复杂而无突变热点或突变频率低于20%的单基因变异,以及多基因致病突变。
(2)胃癌组织基因突变鲁狲、徐惠绵、任群等人利用DHPLC对39例胃癌组织及血清中p53基因突变进行检测,并测序验证。在他们的研究中p53基因的突变率为21%(8/
3
9);其中肠型胃癌突变率40%(6/
1
5)明显高于弥漫型胃癌8.33%(2/
2
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