流式细胞仪分离奶牛精子性控效果的试验研究

摘要用流式细胞仪分离荷斯坦奶牛的精液，检测在冷冻前和冷冻后分离的精子活力。同时，对不同牛群利用分离得到的性控鲜精和性控冻精进行人工输精，对其人工授精效果和性别控制效果进行观察。结果表明：分选后冻前精子活力达到0.60～0.67，分选后解冻精子活力达0.31～0.39；育成牛群性控鲜精输精的情期受胎率高于使用性控冻精输精，经产母牛群性控鲜精输精的情期受胎率高于使用性控冻精输精，但差异均不显著（P＞0.05）；使用性控鲜精、性控冻精进行人工输精，育成牛群情期受胎率高于经产母牛群，且差异显著（P＜0.05）；产母犊率差异不显著（P＞0.05）；用性控精液人工授精的奶牛早期流产率高于非性控精液，但差异不显著（P＞0.05）。

关键词精液分离；流式细胞仪；奶牛；受胎率；产犊率

奶牛性别控制（Sex Control）是通过人为干预或操作，使母牛按照实际需要生产所需性别后代的生物技术。通过性别控制，可以提高奶牛的繁殖效率，加快遗传育种的进程，迅速增加良种奶牛的数量，从而达到改善牛群结构、提高牛群质量、促进奶牛由数量型向质量型发展的目的。因此，性别控制对奶牛业发展有十分重要的意义[1]，性别控制必将推动奶牛业跨越式的发展。

目前，常见的奶牛性别控制方法有2种，即早期胚胎性别鉴定法和利用流式细胞仪进行X、Y精子分离法。利用流式细胞仪分离X、Y精子是根据细胞大小及DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理或化学性质进行细胞的筛选，也是奶牛性别控制的一条新途径，可以分离得到纯度很高的X精子和Y精子群[2]。许多学者在人工授精或显微授精之前就利用分离的X、Y精子控制其性别，因而被许多学者认为是更具有实用价值的方法[3]。该研究主要观察分离后精子的人工授精效果和性别控制效果，以期促进奶牛性别控制方法在奶牛生产中的进一步应用，为完善奶牛性别控制技术提供参考。

1材料与方法

1.1精液的处理 1.2受配母牛

选择宿州地区及附近郊县的大型奶牛养殖小区及奶牛养殖大户进行性控精液人工授精试验。一部分为荷斯坦育成母牛，14～17月龄，体重为350～450 kg；一部分为荷斯坦成年母牛，3～5岁，一产或二产。

首先确定发情母牛，即静立、接受其他牛爬跨者，并确定适宜的输精时间，每天观察发情2次。在母牛发情后8～12 h，利用直肠检查确定卵泡发育侧卵巢，然后将处理后的性控精液输到卵泡发育同侧子宫角内或子宫体内[3]。在发情后60 d进行妊娠诊断。随机进行配种，在每头母牛的1个发情期只配1次，避免造成过大的损失。

1.3调查统计

详细查阅每个奶牛场的配种记录，及时登记试验母牛的产犊情况，进行性别登记。

2结果与分析

2.1精子分选结果

流式细胞仪分离精子的分选速度为25 000个/s，收集速度为3 000～5 000个/s，X精子分选准确率为95%以上。精子自采集后到完成性别分离约需6 h[3]。

2.2分离效果及其对精子活力的影响

使用流式细胞仪分离精子，分选后冻前精子活力达到0.60～0.67，分选后解冻精子活力为0.31～0.39，具体如表1所示。

2.3分离精子（鲜精与冻精）用于不同牛群的性控结果 2.4分离精液人工授精的早期妊娠及流产情况

从表2可以看出，对不同牛群用非性控精液和性控精液进行人工输精，使用非性控精液人工授精的早期流产率为5.13%，性控精液人工授精的早期流产率为6.48%，性控精液人工授精的早期流产率高于非性控精液组，但差异不显著（P＞0.05），属于正常繁殖指数范围。

3结论与讨论

试验结果表明，利用流式细胞分离仪分离的奶牛精液对后代性别比例的影响十分显著。该精液分离技术具有操作简便、思路新颖、方法独特、准确率高、便于推广等特点。相对于其他省份，安徽省奶牛数量少，因而直接导致产奶量很低，原料奶供应严重不足。如将性控精液技术推广应用于奶牛生产中，不仅可以促进奶牛业的快速发展，每年可多产母牛几万头，更重要的是将提高对某些性状的选择强度，加快良种奶牛的繁殖速度。

迄今为止，利用流式细胞仪制备的性控精液已被广泛应用于多种动物，特别是在牛的生产中，已产生很多后代，在这些后代牛中并没有出现表型异常的报道[4-6]。这种现状表明流式细胞仪在分离精子的过程中，精子的遗传物质并没有受到严重伤害。该试验所产的奶牛未出现表现型异常现象。有学者认为，应用流式细胞仪制备的性控精液，其流产率要高于常规精液的应用[7-8]，这从该研究结果得到了验证，但性控精液与非性控精液对人工授精的早期流产率差异不显著。

流式细胞仪分离法也存在劣势，如分离精子的速度较慢，在较短时间内很难获得大量分离精子，而且仪器价格昂贵等，但流式细胞仪精子分离法研究已经取得了非常大的成绩，在部分地区已开始应用于人工授精。随着仪器的改进和各项辅助生殖技术的深入研究、发展，性别分离精子必然将在畜牧生产中得到广泛的应用，产生巨大的社会和经济效益。同时，流式细胞仪分离精子若与体外受精和显微受精技术相结合，将有巨大的发展潜力和广阔的应用前景[9]。

4参考文献 [2] 王子玉，谭景和.流式细胞仪分离精子研究进展[J].中国畜牧杂志，2004，40

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[3] 覃能斌，袁野，孟凡伟，等.利用流式细胞仪分离奶牛精液的性别控制效果观察[J].黑龙江畜牧兽医，2006

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[8] BUCHANAN B R，SEIDEL G E，MCCUE P M，et al.Insemination of mares with low numbers of either unsexed or sexed spermatozoa[J].Therioge- nology，2000，53

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[9] CRAN D G，JOHNSON L A，POLGE C.Sex selection in cattle field trial [J].Theriogenology，1995，136

（19）：495-496中国www.Lwlm.com.