浅析仙鱼汤对小鼠Lewis肺癌的作用

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关键词： 仙鱼汤／药理学 肺肿瘤／中药疗法 细胞凋亡 基因表达调控 细胞培养

1 材料与方法 1.2 瘤株 小鼠Lewis肺癌细胞株由中国医科大学肿瘤研究所提供，广州中医药大学第1附属医院中医肿瘤研究所长期移植传代。 1.4 主要试剂与仪器 碘化丙啶（PI）染液为晶美生物工程有限公司产品；bcl2兔多克隆抗体、即用型过氧化物酶免疫组织化学染色（SABC）试剂盒（SA1022）均为博士德生物工程有限公司产品；RPMI1640培养基为Gibco公司产品；2甲苯、乙醇，均为市售分析纯；超净工作台（苏净集团安泰公司）；冷冻桌面离心机（Eppendorf 5810R Centrifuge）；解剖显微镜（北京电子光学设备厂）；37℃电热恒温水浴箱（上海恒丰仪器仪表有限公司）；ALTRA型流式细胞仪（美国Beckman coulter公司）；CSⅣ型烤片机（孝感市电子仪器厂）；亿鸣200病理图像分析系统（中国亿鸣）。 1.6 分组及给药 接种24h后随机分为5组：仙鱼汤高剂量组（剂量为1.747g/kg）、仙鱼汤中剂量组（剂量为0.874g/kg）、仙鱼汤低剂量组（剂量为0.437g/kg）、CTX阳性对照组（剂量为20mg/kg）、荷瘤模型组。中药各组均予以0.4mL中药灌胃，CTX组予以0.2mL腹腔注射，荷瘤模型组予以0.4mL生理盐水灌胃，均每日1次，给药14d。

1.7 观察指标及检测方法

1.7.1 小鼠生活状态观察 实验过程中观察小鼠的饮食、毛发、活动、精神状态等情况。 1.7.3 细胞周期分析及细胞凋亡检测 取小块瘤组织，加入生理盐水洗净血迹后倒掉，再加入1mL生理盐水，用眼科剪剪碎组织，吸管轻轻吹打，过300目筛，收集单细胞悬液于流式专用管，加入2mL中性磷酸盐缓冲溶液（PBS），1 300r/min离心5min洗涤2次，调整细胞计数约1×106/mL，加入体积分数70％冰乙醇2mL吹打后封口固定，保存于4℃冰箱24h。将固定的单细胞悬液离心，去固定液，加入PBS重新悬浮，洗涤2次，300目筛网过滤1次，加入1mL PI染液（终浓度100mg/L），4℃避光染色30min，流式细胞仪检测，收集50 000个细胞，应用multicycle软件分析凋亡率［5］。 1.7.5 bcl2阳性表达检测 采用免疫组化法。常规石蜡包埋后，4μm厚连续切片，行SABC法免疫组织化学染色，用PBS液代替1抗做阴性对照。光学显微镜下观察，bcl2蛋白染色细胞浆呈棕黄色为阳性。在高倍镜视野（400）下随机计数5个视野。计算出各组的染色强度指数（staining intensity index ，pSII）。pSII＝（pA强度瘤细胞×0）＋（pB强度瘤细胞×1）＋（pC强度瘤细胞×2）＋（pD强度瘤细胞×3）。其中A强度代表细胞浆wu特异性染色；B强度代表细胞浆呈特异性浅棕黄色，染色较浅；C强度代表细胞浆呈特异性棕黄色；D强度代表细胞浆呈特异性深棕色，染色较深。染色强度指数（pSII）的范围在0～3 ［6］。

1.8 统计学分析 采用SPSS 11.5统计软件处理。

2 结果

2.1 1般状况的观察 实验结束后，模型组、CTX组小鼠表现为身体瘦小，活动少，喜聚群，毛发缺少光泽；CTX组小鼠于实验5～7d开始出现脱毛，进食减少；仙鱼汤高、中、低剂量组小鼠脱毛现象少于CTX组及模型组，活动力优于CTX组及模型组。

2.2 各组抑瘤率比较 表1结果表明，仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组瘤体质量均低于模型组（Ｐ＜０.０５或Ｐ＜０.０１）。各仙鱼汤组随着药物剂量的增大，瘤体质量逐渐减轻，抑瘤率逐渐增高。表1 各组Lewis肺癌小鼠的瘤体质量及抑瘤率比较（略）

Table 1 Comparison of tumor mass weight and tumorinhibitory rate in different groups

统计方法：单因素方差分析；①Ｐ＜０.０５，②Ｐ＜０.０１，与模型组比较 2.4 光镜观察 模型组癌细胞大小和形态很不1致，可见瘤巨细胞；癌细胞核体积增大，细胞核和细胞浆比例增大，核的大小、形状、染色不1，可见巨核、多核，核染色深，核染色质呈粗颗粒状，分布不均匀；核仁肥大，数目增多，核分裂相增多，可见不对称性、多极性及顿挫性等病理性核分裂相，间质内淋巴细胞少见（图2-a）。CTX组可见大片坏死，间质见较多的淋巴细胞等炎细胞浸润，纤维组织反应性增生（图2-b）。仙鱼汤各剂量组可见癌巢内坏死面积增大，间质可见淋巴细胞等炎细胞浸润，可见较多的细胞凋亡小体（图2-c、d、e）。

2.5 各组bcl2染色强度指数 凋亡相关基因bcl2的阳性产物主要位于细胞浆，可见大量的细胞浆棕黄色颗粒染色。仙鱼汤各剂量组bcl2的染色强度指数均显著低于模型组（Ｐ＜０.０１），并呈剂量依赖性，而CTX组与模型组比较差异wu显著性意义（Ｐ＞０.０５）。结果见表

3、图3。

表2 各组小鼠Lewis肺癌组织的细胞凋亡率及细胞周期分析（略）

Table 2 Comparison of cell apoptosis ratio and cell cycle analysis in different groups

统计方法：单因素方差分析；①Ｐ＜０.０５，②Ｐ＜０.０１，与模型组比较

a.模型组b.CTX组c.仙鱼汤低剂量组d.仙鱼汤中剂量组e.仙鱼汤高剂量组

图1 各组凋亡率检测流式细胞图谱比较（略）

Figure 1 Results of cell apoptosis ratio detected by flow cytometer in different groups

a.模型组b.CTX组c.仙鱼汤低剂量组d.仙鱼汤中剂量组e.仙鱼汤高剂量组

图2 各组肿瘤组织形态比较（HE染色，×400）（略）

Figure 2 Morphological changes of tumor cells under light microscope in different groups（HE staining，×400）

a.模型组b.CTX组c.仙鱼汤低剂量组d.仙鱼汤中剂量组e.仙鱼汤高剂量组

图3 各组bcl2阳性表达比较（免疫组化，×400）（略）

Figure 3 Positive expression of bcl2 in different groups detected by immunohistochemical method

表3 各组bcl2染色强度指数比较（略）

Table 3 Comparison of staining intensity index of bcl2 in different groups

统计方法：单因素方差分析；①Ｐ＜０.０１，与模型组比较

3 讨论

多数学者认为，肺癌发生发展的中医病机可以用"痰、瘀、虚"3个字高度概括。其中正虚是肺癌发生的基础，《医宗必读》云："积之成者，正气不足，而后邪气踞之。"正虚又以脾虚为主，"脾为生痰之源，肺为贮痰之器"。正是脾虚导致痰浊内生，进1步血停成瘀，瘀血内生，痰瘀内阻，蕴积肺部，日久而发为本病。

广州中医药大学陈锐深教授从肺癌病因病机出发，以健脾清肺、化痰祛瘀为治疗大法，自拟了治疗肺癌的经验方"仙鱼汤"。方中君药为党参，具有补中益气、健脾益肺、生津养血的功效，为补益肺脾气之要药。黄芪配合党参，以补肺脾之气；浙贝母清热化痰、开郁散结；猫爪草散结消肿；3⑦片化瘀散结止痛，共为臣药。仙鹤草收敛止血、解毒抗癌；鱼腥草清热解毒、消痈排脓；天冬养阴清肺生津；山海螺解毒消肿、排脓祛痰；山慈菇清热解毒、化痰消肿散结；守宫散结止痛，共为佐药。炙甘草调和诸药，为使药。综合全方，扶正祛邪，攻补兼施，使祛邪而不伤正，共奏健脾清肺、化痰祛瘀之功效。

【参考文献】

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［4］陈奇．中药药效研究思路与方法［M］．北京：人民卫生出版社，2005：1001.

［5］Li Huschtscha W A，Bartuier C E，Anderson R，et al.Characteristics of cancer cell death after exposure to cytotoxic drugs in vivo［J］.Br J Cancer，1996，73：54.

［6］同济医科大学病理教研室，中山医科大学病理教研室．外科病理学［M］．武汉：湖北科学技术出版社，1999：505.

［7］Rom W N，Hay J Y，Lee T C，et al.Molecular and genetic aspects of lung cancer［J］.Am J Respir Crit Care Med，2000，161：1355.

［8］Hishii M，Kurnick J T，Ramirez Montagut T，et al.Studies of the mechanism of cytolysis by tumorinfiltrating lymphocytes［J］.Clin Exp Immunol，1999，116

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