翻新时间:2013-12-18
简便有效分离培养大鼠主动脉内皮细胞的一种新方法
毕业论文 作者:肖琼 房云海 徐蕴 田铧 张立平 田兴松
【摘要】 目的:探索分离、培养鼠主动脉内皮细胞的有效方法。方法:将鼠主动脉内膜翻向外,结扎两端,置于50 mL培养瓶中培养、传代,Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色。结果:培养6~8 d 时有少量细胞自主动脉迁移出并贴壁生长;12~14 d 时贴壁细胞覆盖大部分培养瓶面,约80%的细胞汇合成单层;传代细胞生长旺盛;细胞汇合后呈现典型的“鹅卵石”样内皮细胞特征,内皮细胞标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性;未见杂细胞。结论:此方法无损伤、不需要酶消化,能比较容易的获得高纯度大鼠原代主动脉内皮细胞,适用于细小血管内皮细胞的分离与培养。
【关键词】 主动脉·体外培养·内皮细胞·大鼠
A new method for isolation and culture of the endothelial cells of the rat aorta
【ABSTRACT】Objective:To investigate a modified method of isolating and culturing the endothelial cells from the rat aorta for endothelial bioresearch. Methods:Turned inside out, the aorta of the rat, of which the intima tunica was exposed, was ligated at both ends and cultured in a 50 mL culture bottle. Results:A small amount of cells migrated out from the aorta 6 to 8 days after cultured; the migrating cells spread over most of the culture surface of the bottle 12 to 14 days after cultured, 80% of them in a confluent monolayer. The confluent cells were identified as endothelial cells with the typical cobblestone appearance and the positive reaction for factor Ⅷ relative antigen, no other types of cells was observed. Conclusion:This is a woundless, nonenzymatic method of obtaining highly purified primary endothelial cells of the rat aorta, especially practical for isolation and culture of small vascular endothelial cells.
内皮细胞是研究心血管、炎症、肿瘤等疾病最常用的工具。目前,对脐静脉等较大血管原代内皮细胞的分离与培养1般采用酶消化法,技术已经成熟。但对于大鼠等小动物血管而言,由于管径细小,操作难度大,其内皮细胞的分离与培养1直存在产量少、易混入杂细胞等问题 [1]。本研究经过反复实验,建立了1种有效获取高纯度、高数量大鼠原代血管内皮细胞的分离与培养方法。
1 材料与方法 1.2 培养方法 1.2.2 细胞传代培养 原代培养约12 ~14 d,迁出生长的细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上,约80 %的细胞汇合即可传代。取出主动脉,用D-Hanks液冲洗培养瓶2次,常规消化、吹打,1 000 r/min离心5 min,弃上清,加入含10% 胎牛血清的DMEM/F12培养液适量,制成细胞悬液,依照细胞的量按1:1或1:2传代培养,3 d换液1次。另9只大鼠以同样步骤重复上述实验。 1.4 细胞纯度分析 取6次培养的第2代主动脉内皮细胞,vWF免疫细胞化学染色后,每张盖玻片400倍镜下随机选5个视野计数细胞,计算细胞阳性表达率(细胞阳性表达率=阳性细胞数/细胞总数)。
2 结果 2.2 免疫细胞化学染色 vWF免疫细胞化学染色,细胞质呈现棕黄色阳性反应。每张盖玻片100倍镜下随机选10个视野进行观察,均未见染色阴性表达细胞(图2)。
2.3 细胞纯度分析 vWF免疫细胞化学染色后,每张盖玻片400倍镜下随机选5个视野计数细胞,所见细胞均为阳性染色细胞,阳性表达率为100%,即获取的内皮细胞纯度为100%。
重复实验10次,均获得同样结果。
[NextPage]
3 讨论 酶消化法可以在相对短的时间内获取细胞。大鼠主动脉较细,本实验发现150 g的大鼠主动脉管径约2 mm,其分支非常细且不易结扎,灌注的酶消化液容易经其分支渗漏至管外,使外膜也被消化,导致其他细胞混入;细胞产量亦较低,且大多需同时获取多条动脉,操作复杂;有时因酶的活性改变而使消化时间难以掌控,不仅影响内皮细胞的分离和提取,亦可直接影响内皮细胞的活力[7]。
组织块移植培养法操作简单,对细胞活力无损伤,缺点为长出的细胞成分比较复杂,内皮细胞纯度低[8],常伴有成纤维细胞污染。由于成纤维细胞生长迅速,最终过度生长甚至覆盖内皮细胞而影响内皮细胞增殖。有学者将大鼠主动脉外膜做瞬间热处理后再进行植块培养,提高获取内皮细胞的纯度至67.8%[6]。 此方法解决了鼠主动脉内皮细胞难获取的问题,也适用于其他较大动物细小血管内皮细胞的分离与培养,为进1步研究其内皮细胞的生物学特性及其相关疾病提供了良好平台。
【参考文献】
[1] Cole OF, Fan TP, Lewis GP. Isolation, characterization, growth and culture of endothelial cells from the rat aorta[J]. Cell Biol Int Rep, 1986, 10
(6):399-405.[3] Battle T, Arnal JF, Challah M, et a1. Selective isolation of rat aortic wall layers and their cell types in culture-application to converting enzyme activity measurement [J]. Tissue Cell, 1994, 26
(6):943-955.[5] Lincoln DW, Larsen AM, Phillips PG, et al. Isolation of murine aortic endothelial cells In culture and the effects of sex steroids on their growth[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2003, 39(3-4):140-145.
[6] 林哲绚,罗文鸿,李慧.瞬间热处理大鼠主动脉内皮细胞分离培养法[J].解剖学杂志,2004,27
(5):571-573.
[7] 李淑香,王佐周,邱雪杉.酶消化对培养脐静脉内皮细胞的影响[J].解剖科学进展,2000,6
(2):186.
[8] Nicosia RF, Villaschi S, Smith M. Isolation and characterization of vasoformative endothelial cells from the rat aorta[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1994, 30A
(6):394-399.
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