研究线粒体DNA表观遗传学进展

1 mt DNA表观遗传学修饰及其作用

1.1 mt DNA表观遗传学修饰酶

DNA甲基化通常抑制基因启动子的活性, 从而影响基因的稳定性, 在哺乳类动物mt DNA也存在5-甲基胞嘧啶 (5m C) 和5-羟甲基胞嘧啶 (5hm C) , 其甲基化亦存在于Cp G二核苷酸之外的区域。

1971年在线粒体内发现含有形成5m C所必需的DNA甲基转移酶 (DNMT) , 表明mt DNA可能含有5m C[3]。随后证据表明, 哺乳动物mt DNA存在5m C, 而mt DNMT1是靶向线粒体序列的核编码DNMT1内源性等位基因, mt DNMT1负责mt DNA胞嘧啶的甲基化, 并参与对mt DNA转录因子的表达调控[4,5]。

除mt DNMT1外, DNMT3A和DNMT3B也参与线粒体表观遗传学调控作用, 具有氧化还原依赖性DNA的去羟甲基化能力, 在特定情况下, 能够将5hm C去羟甲基化[6]。DNMT3A/3B旁系同源物DNMT3L能与DNMT3A/3B相互作用而促进mt DNA发生甲基化。5m C转换为5hm C需要TET酶 (TET1~3) 和Fe2+依赖加双氧酶的催化, TET后续催化5hm C转换成5-甲酰胞嘧啶 (5-f C) 和5-羧基胞嘧啶 (5-ca C) , 这是2种衍生的表观遗传产物, 能够在胸腺嘧啶-DNA糖基化酶和碱基切除修复途径中使5hm C还原为胞嘧啶 (甲基化循环) 。

1.2 线粒体表观遗传修饰产物

1.2.1 mt-5m C:

mt DNMT1表达以及由mt DNA编码RNAs的水平受mt-5m C的影响。mt DNMT1改变会影响mt DNA轻链和重链转录表达, 并与重链上的NADH脱氢酶亚基1 (ND1) 转录增强及与轻链上ND6的mRNA表达降低有关, 可能因为mt-5m C能对基因启动子产生抑制作用, 或某种替代机制能够增强基因表达。mt DNA重链第2个启动子的转录受到线粒体转录因子A (TFAM) 的抑制, 而mt-5m C可能影响TFAM的转录位点和后续转录反应[7]。mt-5m C在重链保守区域 (CSB-Ⅲ) 中的启动子区域, 位于D-loop的5末端, 在重链复制过程中影响RNA引物[8]。mt DNA甲基化参与线粒体的基因表达和生物合成, 但其生理作用仍未知。

1.2.2 mt-5hm C:

5hm C作为甲基化循环的中间产物, 在mt DNA中高丰度分布, 并且能反馈影响TETs的活性。线粒体表观遗传学参与调控衰老的不同生理病理过程, 病变出现在不同月龄的小鼠脑组织中, 衰老阶段的前额叶皮层中mt DNA的5hm C水平降低, mt DNA编码基因包括复合体I组分 (ND2、ND4、ND4L、ND5和ND6) 转录物水平仅在额叶皮层衰老过程中增加, 且衰老影响mt DNMT1和TET1~3的表达;在小脑中, TET2和TET3的mRNA含量增加, 但mt DNMT1的mRNA水平不受影响, 提示哺乳动物大脑的线粒体表观遗传学调控受衰老影响[9]。

1.2.3 其他表观遗传修饰类型:

参与TET介导氧化途径的5-f C和5-ca C, 这两种表观遗传修饰产物的功能尚未阐明。通过T7RNA聚合酶 (T7RNAP) 或人类RNA聚合酶II的体外介导作用, 发现5-f C和5-ca C可导致DNA转录抑制[10]。T7 RNAP与线粒体聚合酶具有高度的同源性, 是mt DNA表观遗传修饰产物的重要转录调控机制。目前, 线粒体表观遗传修饰产物的具体生理作用仍未知, 是未来重要的研究方向之一。

2 线粒体表观遗传修饰产物作为生物学标志

线粒体特异性异常位点的表观遗传修饰可用于临床肿瘤治疗及某些相关疾病的预防策略。探索线粒体基因组5m C和5hm C的含量, 与临床预后、生活方式、膳食及环境暴露之间的关系有重要意义。

mt DNA甲基化产物是新一代的疾病监测生物学标志物, 包括癌症, 神经退行性变和年龄相关的疾病[11];mt DNA的表观遗传修饰位点包括整体和某些特异性片段基因的甲基化。目前, 已经建立mt DNA甲基化与不同环境因素之间的关联, 对暴露于空气污染物 (如暴露于富含金属颗粒物的钢铁工人、富含苯空气的加油站服务员和交通中暴露于含碳、氮化合物的驾驶员) 的工人, 与低水平空气污染的对照组相比, 其Phe-mtRNA和12S rRNA的编码区具有较高的甲基化水平, 该编码区的去甲基化若对于职业病分子水平的预防和控制具有良好的应用前景[12]。

对老年男性受试者进行12S和16S rRNA编码区甲基化胞嘧啶残基的分析, 发现12S rRNA甲基化水平随年龄变化, 随着年龄增加而明显下降。mt DNA的Cp G岛高甲基化与癌症、肌萎缩侧索硬化 (ALS) 、糖尿病性视网膜病变以及机体环境毒物暴露反应有关;唐氏综合征患者发现mt DNA的Cp G岛呈低甲基化状态[13]。mt DNA表观遗传产物作为一种新的生物学标志, 用于相关疾病检测。

3 细胞核线粒体表观遗传交叉串话

线粒体作为一个信号传导的细胞器, 细胞核通过顺行调节 (信号从核到线粒体) 促进其生物合成并调节活性。同时, 线粒体也可通过逆行反应 (信号从线粒体到细胞核) 反向调控核基因的表达, 经重编程而参与修饰细胞的功能。细胞内双向的信息传导称为线核交叉串话, 组成稳定而庞杂的信号网络, 以维持细胞内动态平衡[14]。

3.1 顺行调节

细胞核编码大多数线粒体蛋白并输送到线粒体中执行功能, 通过检测细胞代谢条件变化的多重感受器激活顺行信号通路, 并根据线粒体的生物能量和生物合成输出, 从而适应细胞的不同需求;该过程需激活几种核编码的转录因子和共激活因子, 诱导线粒体基因表达并调节线粒体蛋白质组。

由核DNA编码的聚合酶 (Pol-) 亚酶, 即Pol-A, 负责线粒体复制和修复, 通过其第二外显子内Cp G岛的DNA甲基化调节表达下调;Pol-A表达与mt DNA拷贝数量成线性关系[15]。在哺乳类动物中, 氧化应激影响过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子1 (PGC1) 的稳定性, 可激活几种核编码转录因子[包括核呼吸因子1 (NRF1) ]的转录。PGC1和NRF1形成复合物能上调线粒体转录因子 (TFAM) 和线粒体呼吸链复合体的多个组分转录, 而两者表达均受到DNA甲基化调节。

胸苷激酶 (TK2) 在线粒体中参与脱氧核苷酸合成的补救途径, 在细胞核中能促进维持细胞n DNA完整性。扩张型心肌病患者心脏中TK2基因的启动子区高甲基化而使蛋白水平降低, 最终导致mt DNA耗尽[16]。

核编码miRNA涉及线粒体的外膜或基质, 在线核表观遗传串话中起重要作用, miRNA的存在表明基因表达核线双向调节的复杂性。很多由核编码的miRNA在线粒体中参与调节转录和细胞代谢[17]。对mt DNA转录产物分析和深度测序揭示线粒体基因组内存在编码的miRNA[18]。若其与核对应物类似地调节线粒体基因表达, 则具有影响核基因表达的功能。

DNA发生快速或动态甲基化后与甲基-Cp G结合域蛋白 (MBD) 进行结合发挥作用, 从而对人体细胞分化、增殖和分裂、正常发育、干细胞多能性、基因表达和抑制以及癌症发挥重要作用[19];线粒体也参与其中, MBD家族是否也会进入线粒体或作用于mt DNA, 对线粒体的表观遗传调控机制研究具有重要意义。

3.2 逆行反应

线粒体维持基因组DNA的稳定性, 是氧化磷酸化 (OXPHOS) 的作用位点及众多代谢和信号通路的交叉点。线粒体的代谢反应控制着某些关键信号分子以调节核基因的表达, 并可触发各种逆行信号通路, 且激活许多有利于线粒体稳态恢复和促进细胞存活的反应过程。逆行反应的标志之一是能延长细胞复制和寿命[20]。

3.2.1 组蛋白修饰:

组蛋白修饰严格依赖细胞内的能量状态、线粒体功能及其中间产物的作用。组蛋白乙酰转移酶 (HATs) 和去乙酰化酶 (HDACs) 的活性依赖ATP水平和线粒体功能, ATP和乙酰Co A减少会降低NADH/NAD+还原当量, 而mt DNA损伤会导致线粒体功能障碍, 降低组蛋白特定位点标志物的乙酰化水平, 乙酰Co A消耗可能增加DNA甲基化水平[4]。线粒体三羟酸循环对于组蛋白乙酰化调节非常重要。HDACs利用NAD+从底物的赖氨酸残基移去乙酰基, 尽管去乙酰化酶活性对细胞内NAD+含量敏感, 但缺乏线粒体控制去乙酰化酶的证据而需要进一步研究。

组蛋白去甲基化酶 (HDMs) 包含Jumonji C (Jmj C) 结构域的赖氨酸去甲基化酶 (JMJD) , 可通过2-酮戊二酸 (2-OG) 和Fe (Ⅱ) 激活, 2-OG是TCA循环产物并通过载体运输至细胞核, 作为TET蛋白的底物促进5m C转换, 但琥珀酸和延胡索酸作为JMJD和TET酶的竞争性抑制剂而促使DNA维持高甲基化水平, 在癌症发展过程中是组蛋白和DNA的强诱导剂[21]。研究显示组蛋白甲基化转移酶 (HMTs) 也能调节线粒体功能, 如抑制赖氨酸去甲基化转移酶SETD7/9, 促进线粒体生物合成并通过PGC1和NFE2L2激活抗氧化反应[22]。

3.2.2 mtROS:

OXPHOS副产物和NADPH-氧化酶1 (Nox1) 产生活性氧簇 (ROS) 并影响表观遗传学信号。适量的毒物刺激产生mtROS, 能激活Tel1p和Rad53p (哺乳动物DNA损伤反应激酶ATM和Chk2同源物) , 而Tel1p和Rad53p的OXPHOS, 使亚端粒异染色质H3K36的去甲基化酶Rph1p失活, Rir3p结合增强, 导致端粒相关基因转录沉默, 参与对细胞寿命的调节[23]。过量ROS氧化应激损伤线粒体功能, 对mt DNA产生基因毒性;并导致不可逆氧化损伤和细胞死亡;线粒体基因组邻近ROS位点, 无内含子、保护性组蛋白及有限DNA修复能力, 对ROS损伤尤为敏感。3.2.3线粒体解折叠蛋白反应 (UPRmt) :蛋白质稳态有赖于其结构的折叠与降解的平衡, UPRmt是逆行反应的一种形式, 有助于维持线粒体蛋白的稳态。UPRmt是对蛋白毒性应激的保护性或适应性反应, 可促进线粒体伴侣蛋白和其他应激反应基因表达, 并通过线粒体核反馈信号恢复细胞器的蛋白质内稳态[24]。由ROS引起的线粒体应激反应超过其最大缓冲能力时, 未折叠、错误折叠或未组装的蛋白质就会积累, 最终导致线粒体及细胞的功能障碍。

UPRmt在线粒体稳态、氧化应激反应和线粒体自噬中充当重要的调节者。与线虫有关的UPRmt信号传导的线粒体应激反应显示, 当线粒体电子传递链和其核糖体功能受到抑制时, UPRmt的特异性细胞器蛋白质保护反应激活, 在线粒体应激下, 改变一系列蛋白的性质使得寿命延长, 涉及H3K9和H3K27及其去甲基化酶的作用[25]。

核编码线粒体蛋白和线粒体编码蛋白之间的比例失衡, 与UPRmt以及长寿有关, 辅酶Ⅰ (NAD+) /去乙酰化酶1 (SIRT1) /UPRmt/超氧化物歧化酶 (SOD, 如H2O2) 信号通路与FOXO信号激活的寿命调控之间存在关联。UPRmt与老年造血干细胞的再生能力有关, 激活先天免疫基因的表达, 提示线粒体参与广泛的先天免疫途径, 释放诱导先天免疫和全身炎症反应的线粒体损伤相关分子模式 (DAMPs) 信号[26,27]。

3.2.4 核基因组中mt DNA插入:

mt DNA可转移到真核细胞核基因组并插入生成核线粒体DNA拷贝 (NUMT) 。NUMT在85个以上真核生物基因组中存在, 比较常见, 在肿瘤细胞核基因组中mt DNA整合的重要性仍未知, 但发现在结肠直肠癌中NUMT增加, 提示体内转移mt DNA转移增加, NUMT可作为肿瘤发生相关的生物学标志[28]。

多能干细胞中mt DNA片段转移到细胞核的过程是动态和可逆的[29]。多能干细胞和胚胎干细胞在细胞核中含有高水平mt DNA, 干细胞分化为体细胞时, 基本将细胞核中mt DNA的数量降至与正常体细胞中观察到的水平相似, 这可能是mt DNA序列动态调控多能干细胞染色体DNA的新机制。

线粒体向细胞核提供必要的中间代谢产物, 可调节和修饰表观遗传学标志, 参与细胞核DNA和染色质的表观遗传反应;反过来线粒体也依赖细胞核促进其大部分功能活性, 包括mt DNA的表观遗传修饰, 并参与调控核基因的表达。两者之间的交叉串话在机体代谢、疾病以及衰老中有重大意义。

4 mt DNA表观遗传学研究方法及展望

mt DNA的表观遗传修饰形式, 如mt DNA整体甲基化或特异位点的甲基化, 可与氧化应激、药物及环境暴露之间发生联合作用, 从而导致相应的生理和病理改变, 其作用机制需要深入探究。应用小样本中分离纯化得到的核酸, 进行整体基因组甲基化分析, 有助于研究线粒体碱基的甲基化, 以期作为一个新的生物学标志。具体包括: (1) Bisulfite法主要包括MSP和BSP, 能分辨单个核酸碱基, 可应用于mt DNA甲基化位点的分析; (2) 全基因组扩增法联合亚硫酸氢盐测序 (WGs B) , 通过使用Illumina基因组分析平台, 可用于小真核基因组分析。另外, 有替代方法如与微阵列杂交, 使用特异性抗体免疫沉淀变性DNA法富集甲基化区域;而液相色谱电喷雾离子化串联质谱 (LC-ESI-MS/MS) 可用于基因组和线粒体DNA甲基化测定, 能提供5m C和5mh C清晰分离和特异性定量, 没有任何序列的限制。 (3) 纳米孔测序, 可直接对5m C测序, 能够不使用亚硫酸盐处理进行测序, 将开启高通量DNA甲基化分析的新革命。对mt DNA进行定量分析的甲基化技术方法是未来生命科学发展的重要方向。

对于神经退行性疾病或癌症, 若能建立其特异性mt DNA甲基化谱, 发现其特异性的线粒体表观遗传修饰生物学标志, 对于做好基因水平的源头预防, 具有重要意义。若能研发出特异性靶向修饰mt DNMT和TETs等酶活性的药物, 选择性穿透线粒体生物膜, 进行人为干预mt DNA甲基化, 将具有重要的临床应用价值。在新兴的线粒体癌症治疗策略中, 涉及癌症免疫治疗和CRISPR-Cas9系统基因治疗[30]。

此外, 可从线粒体酶活性方面研究mt DNA甲基化的作用, 如mt DNMT1和TETs酶活性的变化, 在调节哺乳动物mt DNA甲基化和羟甲基化发挥关键作用;以及mt DNA表观遗传调控可能参与的信号通路机制;了解线粒体表观遗传修饰产物作用;揭示线粒体表观遗传酶在正常生理和病理条件下的调节和分布机制;并深入研究核线交叉串话的代谢反应及其机制;这将有助于深度理解线粒体表观遗传学修饰机制对生命进行的精细调控, 发现线粒体与更多细胞器之间的表遗传交叉串话也是重要的发展方向。

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