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SN368 NF-κB激活-核转运检测试剂盒

上传者:潘国锋
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上传时间:2015-04-22
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SN368 NF-κB激活-核转运检测试剂盒

NF-κB激活-核转运检测试剂盒

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产品简介:

NF-κB激活-核转运检测试剂盒(NF-κB Activation,Nuclear Translocation Assay Kit)是通过免疫荧光染色检测NF-κB的主要亚基p65是否转运到细胞核内从而确认NF-κB是否被激活的检测试剂盒。本试剂盒中的NF-κB p65抗体可以识别人、小鼠或大鼠的NF-κB p65亚基,因此本试剂盒可以检测人、小鼠或大鼠细胞或组织中的NF-κB核转运激活。

本试剂盒提供了固定液、洗涤液、封闭液、一抗、荧光标记二抗、细胞核荧光染色液、封片液,使用时不必再配制其它任何溶液。提供了细胞核荧光染色液,可以把细胞核染成蓝色荧光,这样可以清楚地判断NF-κB是否被转运到细胞核内而被激活。

NF-κB是一种常见的转录因子,可以被炎症因子、生长因子或趋化因子等激活。常见的炎症因子(包括Interleukin-1?和TNF-α等)都可以激活NF-κB。NF-κB由两类亚基形成同源或异源二聚体。一类亚基包括p65(也称RelA)、RelB和C-Rel;另一类亚基包括p50和p52。最常见的NF-κB亚基组成形式为p65/p50或p65/p65。

NF-κB未被激活时和IκB-α形成一个复合物,分布在细胞浆中。在炎症因子、生长因子或趋化因子等可以激活NF-κB的刺激存在的情况下,IκB-α会在Ser32和Ser36被磷酸化,随后被泛素-蛋白酶体途径降解。NF-κB和IκB-α解聚后,其核定位序列被暴露,从而被转运到细胞核内促进NF-κB依赖的基因转录。通过免疫染色检测NF-κB的主要亚基p65是否被转移到细胞核内,就可以判断NF-κB是否被激活。

本NF-κB激活-核转运检测试剂盒仅染色p65,不染色RelB、C-Rel、p50和p52。 使用本试剂盒染色后NF-κB呈红色荧光,细胞核呈蓝色荧光。

如果检测组织切片或6孔板内的细胞样品,至少可以检测50个样品,如果检测96孔板内的样品,至少可以检测250-500个样品。

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保存条件:

细胞核染色液-20℃保存,其余试剂均4℃保存,半年有效。其中抗兔Cy3和细胞核染色液需避光保存。

注意事项:

1.

免疫荧光染色时,请注意回收使用过的NF-κB p65抗体和抗兔Cy3。回收后至少可以重复使用10次。 需使用可以观察红色荧光和蓝色荧光的荧光显微镜。 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

对于贴壁细胞:

a. 吸除培养液,用PBS洗涤1次。

b. 加入固定液,固定5-15分钟。固定液的用量充分盖住样品即可,对于6孔板中的样品,通常加入1ml固定液。

c. 吸除固定液,用洗涤液洗涤3次,每次3-5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体,同时要保持样品表面有些湿润,

不能干掉,最后一遍洗涤完时吸尽洗涤液。

d. 加入免疫染色封闭液,室温封闭1小时。免疫染色封闭液的用量充分盖住样品即可,对于6孔板中的样品,通常加入

1ml免疫染色封闭液。

e. 吸除免疫染色封闭液,加入NF-κB p65抗体,室温孵育1小时或4℃孵育过夜。

使用说明:

f. 小心吸出NF-κB p65抗体到适当的容器内,4℃保存,留做下次使用。

g. 洗涤液洗涤3次,每次5-10分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体,同时要保持样品表面有些湿润,不能干掉,最后

一遍洗涤完时吸尽洗涤液。

h. 加入抗兔Cy3,室温孵育1小时。抗兔Cy3的用量充分盖住样品即可,对于6孔板中的样品,通常加入1ml抗兔Cy3。 i. 小心吸出抗兔Cy3到适当的容器内,4℃保存,留做下次使用。

j. 洗涤液洗涤2次,每次5-10分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体,同时要保持样品表面有些湿润,不能干掉,最后

一遍洗涤完时吸尽洗涤液。

k. 加入细胞核染色液(DAPI),室温染色5分钟左右。细胞核染色液的用量充分盖住样品即可,对于6孔板中的样品,通

常加入1ml细胞核染色液。

l. 吸除细胞核染色液,用洗涤液洗涤3次,每次3-5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体,同时要保持样品表面有些

湿润,不能干掉,最后一遍洗涤完时吸尽洗涤液。

m. 滴加适当量的抗荧光淬灭封片液,盖玻片封片后荧光显微镜下观察。NF-κB的染色为红色荧光,细胞核的DAPI染色

为蓝色荧光。

2. 对于悬浮细胞:

a. 离心收集细胞,PBS洗涤1次。吸尽PBS后把细胞适当弹散。

b. 加入固定液,轻轻悬浮细胞,固定5-15分钟。

c. 离心,去除固定液。

d. 加入洗涤液洗涤1次。

e. 取少许洗涤液重悬细胞,滴加到盖玻片或载玻片上,做成涂片。充分晾干后继续后续操作。

f. 洗涤液洗涤2次,每次5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体,同时要保持样品表面有些湿润,不能干掉,最后一

遍洗涤完时吸尽洗涤液。

g. 转1.d。后续步骤同1.d起的步骤。

3. 对于组织切片:

a. 对于石蜡切片先进行常规的脱蜡和水化处理,对于冷冻切片可以直接进行后续步骤。

b. 转1.b。后续步骤同1.b起的步骤。

使用本产品的文献:

1. Xu Z, Lin S, Wu W, Tan H, Wang Z, Cheng C, Lu L, Zhang X.

Ghrelin prevents doxorubicin-induced cardiotoxicity through TNF-alpha/NF-kappaB pathways and mitochondrial protective mechanisms.

Toxicology. 2008 May 21;247(2-3):133-8.

2. Zhuang X, Pang X, Zhang W, Wu W, Zhao J, Yang H, Qu W

Effects of zinc and manganese on advanced glycation end products (AGEs) formation and AGEs-mediated endothelial cell dysfunction.

Life Sci. 2012 Jan 16;90(3-4):131-9.

3. Zhuang XY, Zhang W, Pang XF, Wu WB,Qu WJ

Combined effect of total flavonoids from seed residues of Hippophae rhamnoides L. and zinc on advanced glycation end products-induced endothelial cell dysfunction

Food Chemistry,2012Aug,133(3),906-911

4. Huang Z, Meng S, Wang L, Wang Y, Chen T, Wang C.

Suppression of oxLDL-induced MMP-9 and EMMPRIN expression by berberine via inhibition of NF-κB activation in human THP-1 macrophages. Anat Rec (Hoboken). 2012 Jan;295(1):78-86.

5. Hu F, Yang S, Zhao D, Zhu S, Wang Y, Li J

Moderate extracellular acidification inhibits capsaicin-induced cell death through regulatingcalcium mobilization, NF-κB translocation and ROS production in synoviocytes.

Biochem Biophys Res Commun. 2012 Jul 20;424(1):196-200.

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