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lncRNA研究方案

上传者:潘军
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上传时间:2017-06-07
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lncRNA研究方案

  汉恒在一系列基因载体技术如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、细胞功能学服务的基础上,进一步开发基因及信号通路研究工具,包括自噬流研究工具、lncRNA&环状RNA载体工具、分子载体探针、基于病毒载体的Crispr/Cas9基因编辑工具等。 以核心基因技术为基础,汉恒更加注重技术应用与临床转化。

  lncRNA研究方案1

  lncRNA研究方案2

  lncRNA研究技术手册

  一、lncRNA概述

  lncRNA(LongnoncodingRNAs,lncRNAs)长链非编码RNA,起初被认为是基因组转录的不具有生物学功能的“”,是RNA聚合酶II转录的副产物。然而,近年来的研究表明,lncRNA参与了X染色体沉默,以及染色质修饰,,转录干扰,核内运输等多种重要的调控过程,lncRNA的这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。随着研究的推进,各类lncRNA的大量发现,lncRNA的研究将是RNA基因组研究非常吸引人的一个方向,使人们逐渐认识到基因组存在人类知之甚少的“暗物质”。

  lncRNA的功能分为3方面:

  1)通过修饰染色体参与表观调节-与mRNA相互作用;

  2)通过与转录因子的相互作用参与转录调节-与蛋白(转录因子)相互作用;

  3)通过影响mRNA处理过程参与转录后调节-ceRNA作用模式。

  三种lncRNA机制作用方式,1和2主要发生于细胞核,3则发生在胞质。从研究难度来说,13:1)的RNAinteraction与array并无成熟的研究模式;2)需要RIP和RNApull-down,实验执行难度大风险高;3)转录后调节的研究方法-ceRNA作用模式可行性及阳性率较高,是目前研究最热门的lncRNA作用方式。

  lncRNA的ceRNA作用模式:lncRNA作为竞争性内源RNA(competingendogenousRNA,ceRNA),与microRNA结合,在细胞中起到microRNA海绵的作用。从而降低microRNA的活性,间接上调microRNA

  lncRNA研究方案3

  相关靶基因的表达。

  图:lncRNA的ceRNA作用模式

  1

  汉恒在一系列基因载体技术如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、细胞功能学服务的基础上,进一步开发基因及信号通路研究工具,包括自噬流研究工具、lncRNA&环状RNA载体工具、分子载体探针、基于病毒载体的Crispr/Cas9基因编辑工具等。 以核心基因技术为基础,汉恒更加注重技术应用与临床转化。

  lncRNA研究方案4

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  二、汉恒生物-lncRNA研究专家

  汉恒生物lncRNA研究团队,为您提供基于ceRNA调控机制的lncRNA系统研究方案。大致流程如下:

  1)验证lncRNA的表达水平和细胞内亚定位;

  2)通过网络数据库,预测lncRNA可能结合的miRNAs;

  3)lncRNA结合的miRNAs的信息学筛选及荧光素酶进一步筛选验证;

  4)miRNA靶基因预测与功能富集分析;

  5)miRNA靶基因的筛选、验证及相关功能研究;

  6)lncRNA-miRNA-mRNA

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  调控网络的验证。

  图2汉恒生物lncRNA研究流程示意图

  2

  汉恒在一系列基因载体技术如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、细胞功能学服务的基础上,进一步开发基因及信号通路研究工具,包括自噬流研究工具、lncRNA&环状RNA载体工具、分子载体探针、基于病毒载体的Crispr/Cas9基因编辑工具等。 以核心基因技术为基础,汉恒更加注重技术应用与临床转化。

  三、汉恒生物-lncRNA研究实例

  lncRNA研究方案7

  四、研究步骤解析:

  1、验证lncRNA的表达水平和细胞内亚定位:

  汉恒生物拥有成熟的lncRNA-qPCR验证技术,可验证HOTAIR在不同样本中的表达差异性(如肺癌组织和癌旁组织样本),本例中,HOTAIR在癌组织中的表达量高于癌旁组织。qPCR筛选HOTAIR内源表达丰度高的肺癌细胞系用于后续细胞功能学实验。由于

  lncRNA-miRNA-mRNA调控机制的前提是

  lncRNA研究方案8

  lncRNA在细胞质表达,汉恒生物提供的核质分离和qPCR技术,可确定HOTAIR是否在细胞质中表达。

  2、通过网络数据库,预测HOTAIR可能结合的miRNAs:

  3、lncRNA结合的miRNAs的信息学筛选及荧光素酶进一步筛选验证:

  将HOTAIR序列克隆构建至报告基因载体psiCHECK,合成上述预测到的miRNAmimics及对照,在293T细胞内同时转染miRNAmimics和psiCHECK-HOTAIR,多功能酶标仪检测报告基因的表达水平,并筛选报告基因表达下调的miRNAs(可能有多个,本例中假定选择hsa-miR-17-5p进行后续研究)。

  3

  汉恒生物科技(上海)有限公司地址:上海市浦东新区蔡伦路150号1号楼2楼

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  汉恒在一系列基因载体技术如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、细胞功能学服务的基础上,进一步开发基因及信号通路研究工具,包括自噬流研究工具、lncRNA&环状RNA载体工具、分子载体探针、基于病毒载体的Crispr/Cas9基因编辑工具等。 以核心基因技术为基础,汉恒更加注重技术应用与临床转化。

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  4、miRNA靶基因预测与功能富集分析:对hsa-miR-17-5p

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  进行靶基因预测,结果如下:

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  通过功能富集分析将肺癌相关的基因筛选出来:

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  汉恒在一系列基因载体技术如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、细胞功能学服务的基础上,进一步开发基因及信号通路研究工具,包括自噬流研究工具、lncRNA&环状RNA载体工具、分子载体探针、基于病毒载体的Crispr/Cas9基因编辑工具等。 以核心基因技术为基础,汉恒更加注重技术应用与临床转化。

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  5、miRNA靶基因的筛选、验证及相关功能研究:

  (1)初筛:qPCR验证靶基因在癌组织和癌旁组织中的表达量差异,筛选与lncRNA表达呈正相关的靶基因(本例选择在癌组织中高表达的靶基因);

  (2)进一步筛选:在肺癌细胞系中下调HOTAIR表达(使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具),qPCR验证上述靶基因表达水平。选择HOTAIR干扰后,表达量也明显下调的靶基因作为研究对象,本例中假定为CDK6基因。查询CDK6的功能,发现它主要与细胞周期相关。

  (3)在肺癌细胞系中过表达hsa-miR-17-5p(使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具),WB和qPCR检测CDK6的表达水平;

  (4)在肺癌细胞系中过表达hsa-miR-17-5p(使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具),通过细胞周期和细胞增殖等实验,确定hsa-miR-17-5p对细胞功能的影响;

  (5)双荧光素酶报告基因实验:构建CDK63’UTR报告基因载体,将hsa-miR-17-5pmimics与报告基因载体共转293T工具细胞,多功能酶标仪检测报告基因的表达水平,阐明hsa-miR-17-5p作用于CDK6的分子机制;

  注:为了实验的严谨性,可加入CDK63’UTR区hsa-miR-17-5p预测结合区域的突变体作为对照,进一步说明问题。

  6、肺癌细胞系中干扰HOTAIR,检测CDK6表达水平及细胞功能学研究:

  在肺癌细胞系中干扰HOTAIR(使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具),然后分别进行如下实验:

  1)WB和qPCR检测CDK6表达水平;

  2)qPCR检测hsa-miR-17-5p表达水平;

  3)细胞周期和细胞增殖等实验,研究HOTAIR对细胞功能的影响;

  7、lncRNA-miRNA-mRNA调控网络的验证:

  汉恒生物-lncRNA-miRNA-mRNA调控机制研究解决方案:基于ceRNA作用方式和双荧光素酶报告基因实验,证明lncRNA可rescue下游miRNA对其靶基因的抑制作用。

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  汉恒在一系列基因载体技术如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、细胞功能学服务的基础上,进一步开发基因及信号通路研究工具,包括自噬流研究工具、lncRNA&环状RNA载体工具、分子载体探针、基于病毒载体的Crispr/Cas9基因编辑工具等。 以核心基因技术为基础,汉恒更加注重技术应用与临床转化。

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  本实例的具体流程如下:

  (1)构建HOTAIR报告基因载体,将它和hsa-miR-17-5pmimics共转至293T工具细胞中,多功能酶标仪检测报告基因的表达水平,直接证明HOTAIR对hsa-miR-17-5p的海绵吸附机制;

  (2)使用步骤5(5)中构建的CDK63’UTR报告基因载体,并构建HOTAIR过表达载体,将两者共转至293T工具细胞中,多功能酶标仪检测报告基因的表达水平,可间接证明HOTAIR通过海绵吸附hsa-miR-17-5p,从而上调CDK6靶基因的表达。

  注:为了实验的严谨性,上述双荧光素酶实验可分别加入HOTAIR序列或CDK63’UTR区hsa-miR-17-5p预测结合区域的突变体作为对照,进一步说明问题。

  五、参考文献:

  1、LongnoncodingRNAs:functionalsurprisesfromtheRNAworld.WiluszJE,SunwooH,SpectorDL.GenesDev.2009Jul1;23(13):1494-504.

  2、AlongnoncodingRNAcontrolsmuscledifferentiationbyfunctioningasacompetingendogenousRNA.CesanaM,CacchiarelliD,LegniniI,SantiniT,SthandierO,ChinappiM,TramontanoA,BozzoniI.2011Oct14;147(2):358-69.

  3、ThelongnoncodingRNACASC2functionsasacompetingendogenousRNAbyspongingmiR-18aincolorectalcancer.HuangG,WuX,LiS,XuX,ZhuH,ChenX.2016May20;6:26524.

  4、LongnoncodingRNABC032469,anovelcompetingendogenousRNA,upregulateshTERTexpressionbyspongingmiR-1207-5pandpromotesproliferationingastriccancer.LMH,TangB,ZengS,HuCJ,XieR,WuYY,WangSM,HeFT,YangSM.Oncogene.2016Jul7;35(27):3524-34.

  5、LncRNAHOTAIRfunctionsasacompetingendogenousRNAtoregulateHER2expressionbyspongingmiR-331-3pingastriccancer.LiuXH,SunM,NieFQ,GeYB,ZhangEB,YinDD,KongR,XiaR,LuKH,LiJH,DeW,WangKM,WangZX.MolCancer.2014Apr28;13:92.

  6

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