手机

教育资源为主的文档平台

当前位置: 查字典文档网> 所有文档分类> 科技> > 细胞冻存和复苏

细胞冻存和复苏

上传者:蒋全胜
|
上传时间:2016-09-17
|
次下载

细胞冻存和复苏

目前,细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法,主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻,细胞内外的水分会很快形成冰晶,从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高,pH值改变,部分蛋白质由于上述原因而变性,引起细胞内部空间结构紊乱,溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶,使细胞内结构成分造成破坏,线粒体肿胀,功能丢失,并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变,使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多,随冷冻温度的降低,冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤,而致细胞死亡。因此,细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分,减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质分子量小,溶解度大,易穿透细胞,可以使冰点下降,提高细胞膜对水的通透性,且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外,减少胞内形成冰结晶的机会,从而减少冰晶对细胞的损伤。

二、细胞冻存操作步骤:

(1)选择处于对数生长期的细胞,在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉,用0.25%胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶,加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min10分钟)

(2)去上清液,加入含20%小牛血清的完全培养基,于4℃预冷15分钟后,逐滴加入已无菌的DMSO或甘油,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,细胞浓度为3×1061×107/mL之间。

(3)将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中,安瓿装11.5mL在火焰喷灯上封口,封口处要完全封闭,圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧,并标记好细胞名称和冻存日期,同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)

(4)将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内;置于液氮容器颈口处存放过夜,次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤:先将安瓿置入4℃冰箱中23小时,再移至冰箱冷冻室内34小时(此步可省略),再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时,最后沉入液氮中。 细胞冻存在液氮中可以长期保存,但为妥善起见,冻存半年后,最好取出一只安瓿细胞复苏培养,观察生长情况,然后再继续冻存。

三、常用冷冻设备和材料 常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器,规格有35L350L3两种。使用时要注意以下几点:

(1)一般两周需充液氮一次,至少一 个月充氮一次。液氮温度达-196℃,使用时注意勿让液氮溅到皮肤上,以免引起冻伤。

(2)液氮容器为双层结构,中间为真空层,瓶口有双层焊接处,应防止焊接部裂开。

(3)在装入液氮时,要注意缓慢小心,并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导,使液氮直达瓶底,如有专用液氮灌注装置则更好。若为初次使用,加液氮时更要缓慢,以免温度骤降而使容器损坏。 细胞冻存时常备的材料有:0.25%胰蛋白酶,含10%20%的血清培养液,DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒)2mL安瓿(或专用细胞冻存管)、吸管、离心管、喷灯、纱布袋(或冻存管架)等。

一、细胞复苏的原则 在实际操作中,冻存细胞要进行复苏,再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化,以避免慢速融化水分渗入细胞内,再次形成胞内结晶损伤细胞。

二、细胞复苏的主要操作步骤

(1)佩戴眼镜和手套,从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。

(2)迅速放入38℃水浴中,并不时摇动,在1分钟内使其完全融化,然后在无菌下取出细胞。

(3)1000r/min速度下离心510分钟,弃去上层液,加入适量培养液后接种于培养瓶中,接种浓度1×109/L,置37℃温箱静置培养,次日更换一次培养液,继续培养,观察生长情况。若细胞密度较高,及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中,并加入培养基贴壁培养1224小时后,充去上清,换入新鲜培养基继续培养。

三、注意事项 在细胞复苏操作时,应注意融化冻存细胞速度要快,可不时摇动安瓿或冷冻管,使之尽快通过最易受损的温度段(-50℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高,生长及形态良好。然而,由于冻存的细胞还受其他因素的影响,有时也会有部分细胞死亡。此时,可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉,再补以适量的新培养液,也会获得较为满意的结果。

版权声明:此文档由查字典文档网用户提供,如用于商业用途请与作者联系,查字典文档网保持最终解释权!

下载文档

阅读已结束,如果下载本文可

免费下载 下载

想免费下载本文?

立即加入会员

查字典积分换实物礼品

大量免费文档可下载

创建文辑分享文档

热门试卷

2016年四川省内江市中考化学试卷
广西钦州市高新区2017届高三11月月考政治试卷
浙江省湖州市2016-2017学年高一上学期期中考试政治试卷
浙江省湖州市2016-2017学年高二上学期期中考试政治试卷
辽宁省铁岭市协作体2017届高三上学期第三次联考政治试卷
广西钦州市钦州港区2016-2017学年高二11月月考政治试卷
广西钦州市钦州港区2017届高三11月月考政治试卷
广西钦州市钦州港区2016-2017学年高一11月月考政治试卷
广西钦州市高新区2016-2017学年高二11月月考政治试卷
广西钦州市高新区2016-2017学年高一11月月考政治试卷
山东省滨州市三校2017届第一学期阶段测试初三英语试题
四川省成都七中2017届高三一诊模拟考试文科综合试卷
2017届普通高等学校招生全国统一考试模拟试题(附答案)
重庆市永川中学高2017级上期12月月考语文试题
江西宜春三中2017届高三第一学期第二次月考文科综合试题
内蒙古赤峰二中2017届高三上学期第三次月考英语试题
2017年六年级(上)数学期末考试卷
2017人教版小学英语三年级上期末笔试题
江苏省常州西藏民族中学2016-2017学年九年级思想品德第一学期第二次阶段测试试卷
重庆市九龙坡区七校2016-2017学年上期八年级素质测查(二)语文学科试题卷
江苏省无锡市钱桥中学2016年12月八年级语文阶段性测试卷
江苏省无锡市钱桥中学2016-2017学年七年级英语12月阶段检测试卷
山东省邹城市第八中学2016-2017学年八年级12月物理第4章试题(无答案)
【人教版】河北省2015-2016学年度九年级上期末语文试题卷(附答案)
四川省简阳市阳安中学2016年12月高二月考英语试卷
四川省成都龙泉中学高三上学期2016年12月月考试题文科综合能力测试
安徽省滁州中学2016—2017学年度第一学期12月月考​高三英语试卷
山东省武城县第二中学2016.12高一年级上学期第二次月考历史试题(必修一第四、五单元)
福建省四地六校联考2016-2017学年上学期第三次月考高三化学试卷
甘肃省武威第二十三中学2016—2017学年度八年级第一学期12月月考生物试卷

网友关注

西藏公务员面试每日一练结构化面试模拟题2.2
西藏公务员行测每日一练数量关系练习题答案01.30
西藏公务员面试每日一练结构化面试模拟题答案1.25
西藏公务员面试每日一练结构化面试模拟题答案2.1
西藏公务员行测每日一练言语理解练习题答案01.25
西藏公务员行测每日一练资料分析练习题02.01
西藏公务员行测每日一练言语理解练习题02.07
西藏公务员面试每日一练结构化面试模拟题答案1.24
西藏公务员行测每日一练资料分析练习题答案02.08
西藏公务员面试每日一练结构化面试模拟题1.29
西藏公务员行测每日一练言语理解练习题01.25
西藏公务员行测每日一练言语理解练习题01.29
西藏公务员面试每日一练结构化面试模拟题答案2.8
西藏公务员行测每日一练资料分析练习题02.08
西藏公务员面试每日一练结构化面试模拟题2.6
西藏公务员行测每日一练数量关系练习题02.06
西藏公务员面试每日一练结构化面试模拟题2.1
西藏公务员行测每日一练数量关系练习题01.24
西藏公务员行测每日一练资料分析练习题01.23
西藏公务员行测每日一练判断推理练习题答案01.31
西藏公务员面试每日一练结构化面试模拟题1.30
西藏公务员行测每日一练判断推理练习题01.31
西藏公务员行测每日一练判断推理练习题答案02.05
西藏公务员行测每日一练数量关系练习题02.02
西藏公务员行测每日一练数量关系练习题答案01.24
西藏公务员行测每日一练判断推理练习题02.05
西藏公务员面试每日一练结构化面试模拟题答案2.5
西藏公务员面试每日一练结构化面试模拟题2.7
西藏公务员行测每日一练言语理解练习题答案02.07
西藏公务员行测每日一练数量关系练习题01.30

网友关注视频

沪教版牛津小学英语(深圳用) 四年级下册 Unit 7
沪教版八年级下册数学练习册20.4(2)一次函数的应用2P8
19 爱护鸟类_第一课时(二等奖)(桂美版二年级下册)_T3763925
【部编】人教版语文七年级下册《泊秦淮》优质课教学视频+PPT课件+教案,湖北省
外研版英语七年级下册module3 unit1第二课时
第8课 对称剪纸_第一课时(二等奖)(沪书画版二年级上册)_T3784187
小学英语单词
《小学数学二年级下册》第二单元测试题讲解
8.对剪花样_第一课时(二等奖)(冀美版二年级上册)_T515402
外研版英语七年级下册module3 unit2第二课时
七年级英语下册 上海牛津版 Unit9
外研版英语七年级下册module1unit3名词性物主代词讲解
冀教版小学数学二年级下册第二周第2课时《我们的测量》宝丰街小学庞志荣
精品·同步课程 历史 八年级 上册 第15集 近代科学技术与思想文化
3.2 数学二年级下册第二单元 表内除法(一)整理和复习 李菲菲
冀教版小学数学二年级下册第二单元《租船问题》
沪教版牛津小学英语(深圳用) 五年级下册 Unit 7
【部编】人教版语文七年级下册《泊秦淮》优质课教学视频+PPT课件+教案,辽宁省
七年级英语下册 上海牛津版 Unit3
每天日常投篮练习第一天森哥打卡上脚 Nike PG 2 如何调整运球跳投手感?
【部编】人教版语文七年级下册《过松源晨炊漆公店(其五)》优质课教学视频+PPT课件+教案,江苏省
沪教版牛津小学英语(深圳用) 五年级下册 Unit 12
冀教版小学数学二年级下册第二单元《有余数除法的整理与复习》
8.练习八_第一课时(特等奖)(苏教版三年级上册)_T142692
青岛版教材五年级下册第四单元(走进军营——方向与位置)用数对确定位置(一等奖)
沪教版八年级下册数学练习册21.3(2)分式方程P15
第五单元 民族艺术的瑰宝_16. 形形色色的民族乐器_第一课时(岭南版六年级上册)_T3751175
冀教版小学数学二年级下册1
第五单元 民族艺术的瑰宝_15. 多姿多彩的民族服饰_第二课时(市一等奖)(岭南版六年级上册)_T129830
二年级下册数学第三课 搭一搭⚖⚖
细胞冻存和复苏
免费下载
次下载 获取更多特权