鲍曼不动杆菌耐药性及β内酰胺酶基因型研究

中华检验医学杂志:##!年""月第:(卷第""期$+IE?‘7@QC>L，YDF>PQ>J:##!，5DS:(，YDV"" ()!

论著

鲍曼不动杆菌耐药性及!内酰胺酶基因型研究

黄支密$陈榆$毛培华$吴晶$仵蕾

$$【摘要】$目的$明确浙江湖州地区临床分离的鲍曼不动杆菌耐药性及!内酰胺酶基因型。方法$采用%&’药敏试验条板微量肉汤法测定临床分离的(#株鲍曼不动杆菌对")种抗菌药物的敏感性，采用聚合酶链反应（*+,）及序列分析的方法分析!内酰胺酶基因型。结果$鲍曼不动杆菌对亚胺培南、美洛培南的耐药率为"-./，哌拉西林0他唑巴坦的耐药率为1)-!/，对其他抗菌药物的耐药率均在2#/以上。有")株菌株扩增到345型!内酰胺酶，".株为63’783459":，另"株（4;#"株）扩增序列全长含):(个核苷酸，与3459"相比，第!2、"<"、:!)、:1#位氨基酸有不同，被命名为34591)（=>?’@?A登录号：%B:2<"(1）。结论$浙江湖州地区临床分离的鲍曼不动杆菌耐药严重，至少存在!种不同类型的!内酰胺酶，基因型分别为3459":、34591)、&6C9"。

【关键词】$不动杆菌属；$!内酰胺酶类；$基因；$序列分析

!"#$%&’"()*)+,+"-’.)-’$/)’&"%0,’/&1!23-."-4-+)+,’5.,’)"&6-.")*6-#4-’’,,!"#$%&’()*+)，,"-%./，0$123)*(/4，5#6)78，5#93):;3<4=>+37>?@,A)7)B4A94C?=4>?=)3D，0)B=?C)?A?8E94C?=4>?=E，F(329$GH>("?D<)>4A，"/I(?/JKJLLL，,()74【56+"*-."】$768).",9)$&DE?F>8GEH@G>GI>J>8E8G@?K>@?LH>?DGMNE?HDO!97@KG@P@8>8E?%KE?>GDQ@KG>JQ@RP@??EEE8DS@G>LOJDP4RTIDR，;I>UE@?HNJDFE?K>V:)"(&$+$CEKJDLESRG>G>8G8W>J>N>JODJP>LGDL>G>KGGI>8R8K>NGEQESEGMDO")AE?L8DO@?GEPEKJDQE@S@H>?G8@H@E?8G(#8GJ@E?8DO%KE?>GDQ@KG>JQ@RP@??EE=>?DGMN>8DO!9S@KG@P@8>8W@8@?@SMT>LQM*+,@?LF>JEOEK@G>LQMXY%8>ZR>?KE?HV;)+#3"+&I>J>8E8G@?GJ@G>8DO(#8GJ@E?8GD[PEN>?@P，C>JDN>?>P@?L*EN>J@KESSE?0&@TDQ@KG@PW>J>"-./，"V./@?L1)-!/，J>8N>KGEF>SMV&I>J>8E8G@?GJ@G>8GDDGI>J@?GEPEKJDQE@S@H>?G8W>J>PDJ>GI@?2#/V345GMN>

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$$近年来，革兰阴性细菌产!内酰胺酶耐药性问

［"9)］题，受到广泛关注。

研究。

材料和方法

"V菌株来源：(#株菌株均分离自我院:###年.月_:##:年":月住院病人临床标本，分别为：痰液!!份、创伤伤口分泌物"!份、烧伤创面分泌物"#份、气管切开口分泌物:份、中段尿和血液各"份，并经生物梅里埃公司%*[:#Y6重新鉴定。标准菌株为大肠埃希菌%&++:2<::、肺炎克雷伯菌%&++.##(#!和绿脓假单胞菌%&++:.)2!。

:V药敏试验：采用生物梅里埃公司%&’药敏试验板测定")种抗菌药物的敏感性。

当前，多重耐药鲍曼不动杆菌（@KE?>GDQ@KG>JQ@RP@??EE）已成为医院感染的重要病原菌，其分离

［.］率在非发酵菌中仅次于绿脓假单胞菌，常导致严

重的医院感染如菌血症、脑膜炎或肺炎。近年来在鲍曼不动杆菌中已发现*6,9"型63’78，]^%型、[C*型!内酰胺酶。为明确我院鲍曼不动杆菌耐药性情况，对我院临床分离的(#株鲍曼不动杆菌进行

作者单位：!"!###湖州，解放军第九八医院检验科（黄支密、陈榆、吴晶、仵蕾），医务处（毛培华）

0.- 中华检验医学杂志,++2年**月第,0卷第**期!VCPU^(HQTIO，:K_I‘QIL,++2，AKG,0，:K>**

!!2>!内酰胺酶基因扩增：引物由无锡市克隆遗传技术研究所提供。采用蛋白酶S消化法提取模板9:$。H>;%TU7V@：外套引物7*，/W6$;$$$$;;V;;8$$8$V8$$$62W，7,，/W68$V$8;;$VV$$;8V;;$$;V$62W；内套引物72/W6$88$$8$8;$;8$;;V$$V$62W，7-，/W6V;V8;V8;;;$;88V62W，终产物长/2/Q4。Q>&XAU7V@：外套引物7*，/W6;V88VV;;V$V;V$$88$;862W，7,/W6;;$8V8;;8VV$8;8V;V62W；内套引物72/W688;;$;8V8;;$;$;;V8VV62W，7-，/W6;VVV8V$8$;$$$;V$VV$62W，终产物长1.0Q4。Y>"#$7V@：7*，/W68;V;;;V［$E8］$8;$V88V$;;$62W，7,，/W68$;;;;V;;$8V88V$$V;;$62W，产物长.,,Q4。O>V;#6T7V@：7*/W6$;88;;$$$$$$;V$V;8V8VV62W，7,/W6$;8$;8$V;V$8$8V$;;V862W，72/W6V88VV;8;$;;;V8V;8;;862W，7-/W6;VVV8$V88V;;;VV8VV;;62W。其中7*、7-能扩增V;#6T*、2、0、1、*+和;"X"6*，产物长.22Q4；7,、7-能扩增V;#6T,、-、/，产物长.22Q4；72、7-能扩增V;#6T.、3，产物长132Q4。I>A%’7V@7*/W68V88;$$;;;$$VV$8$62W，7,/W68VV;$;8$8VV$8;8;;62W，产物长30*Q4。Z>7%@7V@：7*，/W6$8;V$8V88V;;$8$;$62W，7,/W6V8;$;8$$$$88$$88V$$;V62W产物长31.Q4。设置各型7V@扩增参数，于7%30++基因扩增仪扩增。7V@产物电泳%’染色后，紫外灯下观察结果并拍照保存。以;%T6*、

&XA6*.、V;#T62为阳性对照，纯水为阴性对照。

->核苷酸序列测定及分析：7V@产物纯化后，按&HUMIL双脱氧末端终止法，用$’5自动9:$测序仪进行正反向测序，结果在8IU’HU[网上查对比较。

结

果

*>药敏试验结果：0+株鲍曼不动杆菌，对碳青霉烯类抗生素亚胺培南、美洛培南的敏感率高达3.\2]，但对第三、四代头孢菌素的耐药率达/.\2]B.+]（表*）。

表"!0+株鲍曼不动杆菌对*.种抗菌药物的敏感性

抗菌药物

阿莫西林

阿莫西林E克拉维酸哌拉西林

哌拉西林E他唑巴坦替卡西林

替卡西林E克拉维酸头孢噻吩头孢噻肟头孢他啶头孢吡肟氨曲南亚胺培南美洛培南复方新诺明阿米卡星庆大霉素环丙沙星

敏感株数

（]）2（/>+）**（*.>2）*+（*0>1）,,（20>1）**（*.>-）*-（,2>-）+（+>+）/（.>2）**（*.>2）3（*/>+）-（0>1）/3（3.>2）/3（3.>2）.（*2>2）.（*2>2）.（*2>2）*,（,+>+）

中敏株数

（]）1（**>1）*3（2*>1）*（*>1）3（*/>+）+（+>+）**（*.>2）+（+>+）1（**>1）0（*+>+）*0（,0>1）*,（,+>+）+（+>+）+（+>+）+（+>+）+（+>+）+（+>+）+（+>+）

耐药株数

（]）/+（.2>2）2+（/+>+）-3（.*>0）,3（-.>2）-3（.*>0）2/（/.>2）0+（*++>+）-.（.+>+）-2（1*>1）2/（/.>2）--（12>2）*（*（

*>1）*>1）

/,（.0>1）/,（.0>1）/,（.0>1）-.（.+>+）

表!!"#$型%&’()基因型及其氨基酸序列变异

"#$6*+6**6*-6*06*16*36,.62/6,6*/6*.62,6*62*

$A

$7

@8

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:::

&

&&&

98

见序列资料

5

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8

9

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888

:::

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别名7&%6,

氨!基!酸!位!点

*+5

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450>*0>-0>,0>,0>*1>/.>*.>+1>1.>+/>/

参考

文献*,-2，/3.***-01*+*/*,*2

!!注：表,中参考文献*B*/见网站：CDD4EEFFF>GHCIJ>KLME)DNOPI)EFIQD>H)4R"#$

中华检验医学杂志"((2年,,月第"’卷第,,期!%VU>aC?S+=K，]MZ=RS=J"((2，1MT"’，]M#,, ’.E

!!"#!内酰胺酶编码基因$%&扩增结果：’(株鲍曼不动杆菌)*+型引物扩增全部阳性，阳性率达,((-；,.株/01型引物扩增阳性，阳性率达2(3(-；456组、%)57+7,组、%)57+7"组、%)57+78组、$*&及1*9组引物扩增均为阴性。

2#$%&产物测序结果：’(株)*+型全部阳性，任选.株测序结果均为)*+7,型，其中0:;(菌株)*+7,序列已在<=>9?>@登录（6A"’222,）。,.株/01型阳性，经测序其中,B株为/017,"型*/9CD，其中0:("菌株/017,"序列也在<=>9?>@登录（6A"E8,’2）。

另外,株（编号为0:(,）的核苷酸序列与广谱酶/017,的编码基因（6F,";8.;）相比有8个位点不同，其中第8"、E’(、B((、B(2位核苷酸分别由“)、<、<、<”均突变为“6”，相应编码的第2E、,8,、"2.、";(位氨基酸分别由亮氨酸、精氨酸、苷氨酸、谷氨酸变成了谷氨酰胺、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸。第;(B、;.E、E,.、E’8、B8,位核苷酸分别由“6、%、%、<、%”变为“<、)、)、6、<”，但其相对应的氨基酸未发生改变，已在<=>9?>@登录被命名为/017;.，（6A"E8,’;）。

讨

论

在浙江省湖州地区临床分离的’(株鲍曼不动杆菌中均存在)*+型!内酰胺酶，但经对.株测序表明均为)*+7,型经典酶；同时有,.株产/01型其中,B株产/017,"型*/9CD，另,株!内酰胺酶，

产生一种新的!内酰胺酶/017;.。本研究未测出$*&7，1*97酶，特别是常见于鲍曼不动杆菌的4567*/9CD，可能是所选引物太少和方法尚待改进。

志谢!北京协和医院陈民钧教授、浙江大学医学院附属第一医院俞云松教授、江苏无锡市克隆遗传技术研究所糜祖煌教授，对本研究给予的大力支持和指导

参考文献

本研究结果显示，在浙江省湖州地区临床分离的鲍曼不动杆菌耐药性严重，仅对碳青霉烯类抗生素有较高的敏感性，对其他抗菌药物的耐药率均在E(-以上或接近E(-。鲍曼不动杆菌中存在多种!内酰胺酶，在土耳其和上海相继发现了$*&7,型

［E，8］［,(］

*/9CD，香港发现了G+$型金属!内酰胺酶。

但目前已发现;(种456型!内酰胺酶，其中只有,;种属于*/9CD。与)*+和/01型*/9CD不同的是，456型*/9CD由4567"、4567,(和4567,三个基因来源的，它们相互之间同源性很低，具体基因型及各基因型氨基酸突变位点见表"。其HG在E3EI.3,之间。456主要发现于绿脓假单胞菌和不动杆菌中。法国最近又发现了4567;(型

［,,］碳青霉烯酶。

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"((2，;B："’.7"B2#%V=RMOV=J，

（收稿日期："((27(E7,’）

（本文编辑：毛家都）

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!!袁桂清（本刊分机：,;(E）!张莉（,;;B）!毛家都（,;;8）!李建陵（";((）!唐栋（,;"B）!周彩霞（";(,）