FACSComp软件

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第3章 FACSComp软件

3.1 概述

FACSComp是BD公司自动设置仪器条件的应用软件，它可通过标准微球（CaliBRITE beads）来监测仪器的工作状态，还可以为人类外周血淋巴细胞免疫分群的应用和强直性脊椎炎鉴定中HLA-B27指标的检测提供常规的、自动化的仪器设置。流式细胞仪包含了一些灵敏的光电元件，为了保证实验结果的一致性，最好每天用CaliBRITE beads来运行FACSComp软件。

3.2 运行条件

1、 BD CaliBRITE beads：已知光散射和荧光强度的标准塑料微球，大小在5-6 um 左右。

BD公司生产的beads包括下列6种：无荧光标记微球（unlabeled beads） FITC-标记微球（FITC beads） PE-标记微球（PE beads） PerCP-标记微球（PerCP beads） PerCP-CY5.5-标记微球（PerCP-CY5.5 beads）APC-标记微球（APC beads）

每一种beads都有一个相应的6位编码（lot ID），例如，12493N。其中最后一位代码决定了下列值：

B) FSC和SSC的最小separation values（unlabeled bead的后缀）;

C) FL1，FL2和FL3的最小separation values（FITC，PE，PerCP，PerCP-CY5.5- bead的后缀）; D) FL4 PMT的靶值（APC-bead的后缀）;

E) FL4的最小separation values（PerCP，APC-bead的后缀）。

2、 鞘液：用于稀释CaliBRITE beads制成新鲜悬液。 3、 BD FALCON流式管。

3.3 实验流程

3.3.1 制备标准微球

1、 标准微球CaliBRITE beads请保存在4度

2、 根据下表所示，准备两管标准管管1和管2：充分混合所有CaliBRITE beads，垂直向下滴一滴到鞘

液中，混匀，避光放置待测。 ?

?

3.3.2 执行FACSComp软件

1、 先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常连接。

2、 在显示屏下方的Dock菜单中选择FACSComp图标，并点击打开FACSComp软件，出现FACSComp

主页面。

Dock菜单

FACSComp软件

3、 在 Sign In 窗口下：输入操作者，单位及实验室主任，其中操作者是必须的。然后以鼠标点击

「Accept」，进入Set UP窗口。

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4、 在 Set Up 之窗口下：可进行确认每一次分析的数据：

分析模式选择：选择Lyse/Wash或者Lyse/No Wash或者HLA-B27

?

?

?

Lyse/Wash 用于溶血素洗涤的样本（两色、三色或四色）； Lyse/No-Wash 用于溶血处理后免洗的样本（三色或四色）； HLA-B27 用于做HLA-B27抗原检测的样本，它必须在Lyse/Wash检测成功的基础之上 并用HLA-B27调试微球才可进行。 输入CaliBRITE beads的批号：根据试剂盒包装内的标签，分别输入Unlabeled- beads/FITC- / PE-

/PerCP-/APC-beads的批号。

注意beads批号为六位编码，最后一位为大写字母。

? 勾选自动储存。

5、 然后点击「Run」，软件进入PMT窗口

6、 在 PMT 窗口下：用 “管1” 为样品，选择RUN/HIGH。点击「Start」自动调节光电倍增管的电压，

屏幕出现闪烁“PMTs Set Successfully”，便可点击 「Next」。

选择存储文件，确认需要存储的文件前打?。

7、 在 Comp 窗口下：用 “管2” 为样品，选择RUN/HIGH。点击「Start」可执行自动调节荧光补偿： FL1

- % FL2, FL2 - % FL1和 FL3 - % FL2。屏幕出现闪烁“Compensation Set Successfully”，便可点击「Next」。

8、 在 Sens 窗口下：依然用 “管2” 为样品，点击「Start」可自动检测各参数的灵敏度。

9、 在 Summary Report窗口下：可得到所有检测的结果。

10、 完成后，移去标准微球管并插上蒸馏水试管。在Summary Report 状态下点击 Quit 键。或从

File menu 中选择 Quit，退出程序。

11、 当打印对话框出现时，点击OK。将打印一份总结报告，请将报告归档备查。

3.3.3 文件的存储位置

执行完一次FACSComp软件后将得到Summary Report和仪器条件两份文件，这两个文件分别有默认的存储路径。

Summary Report：FACStation?BD Files?FACSComp Files?DDMMYY Files?DDMMYY

仪器条件：FACStation?BD Files?Instrument Settings Files?Calib file/Calib file.LNW/HLA-B27

3.4 FACSComp软件的功能

3.4.1 光电倍增管（PMT）电压的调节

光电倍增管可以有多种电压设置，而电压设置的不同将影响到它的探测灵敏度，增大电压也就意味着信号的放大和channel值的增高。

FACSComp首先根据FSC的强度设一个上限和一个下限来减小双联体（两个bead粘在一起）和碎片的影响，然后根据unlabeled-beads所对应的Target Value来调节SSC、FL1、FL2和FL3 PMT的电压，使它们的平均值在Target Value±2的范围内。由于FL4几乎探测不到Unlabeled beads的自发荧光，因此FL4 PMT的电压必须通过APC beads所对应的靶值来调节。FSC探测器是一个光电二极管，没有可连续变化的电压，因此也不存在FSC的target channel。

软件还设定了阈值，例如，对于Lyse/Wash Assay设定FSC的阈值为52；对于Lyse/No Wash Assay，设定FL3的阈值为300，然而，这些阈值在FACSComp运行过程中不会用到，并且是可以改变的。

FACSComp运行过程中，FACSComp先获取5000个beads，在单个beads群的位置设一个gate，然后开始自动调节PMT的电压。对于双激光配有FL4 PMT的仪器，软件会检查unlabeled试管中是否含有APC-beads，如没有，第二根激光器将被关闭，软件只会调节FL1、FL2或FL3的PMT；如有APC-beads，且在Set Up时APC-beads Lot ID也已经输入，则软件将会调节FL4的PMT。FACSComp根据Target Value调节PMT到预期值，然后在窗口的底部出现一行信息“PMTs Set Successfully”。这时软件会暂停5秒，然后自动进到下一个调节-补偿或是时间延迟的调校（如有APC-beads）。

如遇到下列两个情况中的任何一个，FACSComp将进入到手动调节的模式：

? 流速小于400粒子/每秒

? PMT自动调节的时间长于75秒

单击Manual键，出现Target Value窗口，根据TargetValue调节Detectors/Amps，使得SSC的PMT在Target Value±5的范围内，而荧光的PMT在Target Value±2的范围内。

3.4.2 荧光补偿的调节

应用于流式细胞仪上的大多数荧光染料的发射波谱都会发生叠加，光学滤镜可以最大限度地减小这些信号的叠加，但却不能消除。FACSComp可以用FITC-、PE-、PerCP-、APC-以及unlabeled-beads的混合物来调节荧光之间的补偿，而这补偿是通过调节电路来实现的。

FL1-%FL2 从FL1探测器中减去PE的信号

FL2-%FL1 从FL2探测器中减去FITC的信号

FL3-%FL2 从FL3探测器中减去PE的信号

FL3-%FL4 从FL3探测器中减去由488nm激光器激发的APC的信号

FL4-%FL3 从FL4探测器中减去由635nm激光器激发的PerCP的信号

* 由于PerCP的信号不会被FL2收集，因此FL2-%FL3是不需要的。

软件运行中，需要注意：

? 标有不同荧光的beads群在垂直或水平方向上的线形度可能不是很好，比如说，FL3-%FL2显

得有些不够补偿，软件之所以这样设置是因为这种补偿条件更适合于细胞；

? 在补偿的值设定后，荧光道数的平均差可能出现轻微变动，这是一种正常现象；

? FL3-%FL4和FL4-%FL3的值在两次FACSComp中有可能出现相当大的变化，这是因为每一次

时间延迟的设置有可能不一样，尽管如此，每一次FACSComp所提供的补偿的值都是合适