酸性染料比色测定玛咖总生物碱含量的条件考察

１４２广东农业科学２０１１年第５期

酸性染料比色测定玛咖总生物碱含量的条件考察

杜广香，浦跃武

（华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州５１０００６）

摘要：以乌头碱为对照品．采用酸性染料比色法测定了玛咖总生物碱的含量，并对其显色条件进行选择。结果表明，玛咖生物碱含量测定的最佳条件为：乌头碱对照品在４０—３２０斗ｇ范嗣内，ｐＨ４．０氢氧化钠一邻苯二甲酸氢钾缓冲液６ｍＬ及其配置的０．５％溴｜ｆＩ酚绿显色剂２ｍＬ。显色５０ｒａｉｎ。４１２ｔｉｍ处检测。此法测得玛咖粉末中总生物碱含量约为４．６５‰．且该法操作简便、精密度高、稳定性好、具良好的可蓖复性。

关键词：酸性染料比色法：玛咖：总生物碱

中图分类号：Ｒ２８２．４文献标识码：Ａ文章编号：１００｜４—８７４Ｘ（２０１１）０５－－０１４２－０３

ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌａｌｋａｌｉｏｄｓｉｎＭａｃａｂｙａｃｉｄｄｙｅｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ

ＤＵＧｕａｎｇ－ｘｉａｎｇ，ＰＵＹｕｅ－ｗｕ

（＆ｈｏｏｔｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇ＝ｈｏｕ５１０００６，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈｔｈｅａｃｏｎｉｔｉｎｅ鹊ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ．ｔｈｅ

ｄｙｅｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙａｎｄｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄ

３２０恤ｇ．Ｂｅｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｃｏｌｏｒｉｎｇ

ｇｒｅｅｎｗｅｒｅｐａｐｅｒｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌａｌｋａｌｏｉｄｓｉｎｗａｓＭａｃａｂｙａｄｉｄｒａｎｇｅｗｅｒｅａｌｓｏｐａｒｉｆｉｅｄ．Ｔｈｅｌｉｎｅａｒｉｔｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｆｏｒｔｈｅａｃｏｎｉｔｉｎｅｉｎｔｈｅｏｆ４０－ｔｈａｔｐＨ４．０ｓｏｄｉｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄｅ—ｐｏｔａｓｓｉｕｍａｃｉｄｐｈｔｈａｌａｔｅｂｕｆｆｅｒｗ船６ｍＬａｎｄ０．５％ｂｒｏｍｏｅｒｅｓｏｌａｔｃｏｌｏｕｒｒｅａｇｅｎｔ２ｍＬｗｅｒｅａｄｄｅｄ．ｆｏｒ５０ｍｉｎｕｔｅｓ．ａｎｄｄｅｔｅｃｔ

ｗａｇ４１２ａｍ．ＩｔＷａｓａｂｏｕｌ４．６５‰ｏｆｔｏｔａｌａｌｋａｌｏｉｄｓｉｎＭａｃａｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｒｅｓｅｓｒｃｂ

Ｋｅｙｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｓｉｍｐｌｅ，ａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｔａｂｌｅ，ａｎｄｒｅｐｅａｔａｂｌｅ．ｗｏｒｄｓ：ａｃｉｄｄｙｅｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ；Ｍａｃａ；ｔｏｔａｌａｌｋａｌｏｉｄｓ

玛咖（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ

３５００ｍｅｙｅｎｎｉｉＷａｌｐ）为十字花科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）１．２试验方法１．２．１供试品溶液的制备取玛咖粉末５．Ｏｇ于２５０ｍＬ独行菜属（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ）１年生草本植物。原产于秘鲁海拔ｍ以上的安第斯山区．在营养成分和增强精力、耐

力的功效方面可以与人参媲美。因此又常被称为

“ＰｅｒｕｖｉａｎＧｉｎｓｅｎｇ（秘鲁人参）”０１。三角烧瓶中．加入２００ｍＬ９５％乙醇．置于功率为１５０Ｗ的超声波清洗器中，温度６０℃下超声提取４０ｍｉｎ，提取液５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ．残渣重复提取２次，提取液５０００

玛咖生物碱组分是玛咖中种类较多、活性研究最为ｄｍｉｎ离心５ｍｉｎ．合并上清液．浓缩得浸膏。１０ｍＬ２％的

ＨＣＩ溶解，过滤，残渣用１０ｍＬ２％盐酸洗涤２次，合并滤活跃的一个组分。在结构未明的情况下，总生物碱常用的

检测方法有滴定法和酸性染料比色法１２－３１，两种方法各有

优缺点。本研究对玛咖总生物碱的酸性染料比色法进行

了研究与探索．并对其显色条件进行了优化。

１材料与方法

１．１试验材料

主要仪器：ＷＦｚＵＶ一２８０２ＳＨ型紫外可见分光光度计液。用浓氨水调节滤液ｐＨ值至２—３，等体积氯仿萃取３次。将酸提取液用５‘ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ调节ｐＨ值至９。１０，等体积氯仿萃取３次。合并萃取液．蒸发浓缩至５ｍＬ，即得玛咖总生物碱的供试品溶液。１．２．２对照品溶液的制备精密称取乌头碱对照品２５．０ｍｇ于２５ｍＬ的容量瓶中，加氯仿溶解并定容，摇匀即得浓度为１．０ｍｇ／ｍＬ的对照品溶液。

（上海尤尼柯仪器有限公司），ＫＱ一４００ＫＤＥ型高功率数控

超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），日本ＥＹＥ－旋

转蒸发仪（托普仪器有限公司），ＴＤＬ一５０００Ｂ型低速冷冻离

心机（上海安亭科学仪器厂），ｐＨ计（上海宜虹仪器仪表有

限公司），精密电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公

司）。

药品及试剂：玛咖粉末．购于秘鲁利马；乌头碱由中

国药品牛物制品检定所提供，纯度ｉ＞９８％；水为蒸馏水；氯２结果与分析２．１测定波长的选择测定波长的选择参照文献［３－４】的方法进行。精密吸取供试品及乌头碱对照品溶液各１．ＯｍＬ，置于２５ｍＬ磨口试管中，氯仿定容。按标准曲线项下规定的方法显色，采用全波长扫描方法，在３００—７００ｎｎｌ波长范围内进行扫描。结果表明，供试品在４１０～４１６ａｍ处有最大吸收峰．乌仿、乙醇、溴甲酚绿等试剂均为分析纯。

收稿日期：２０１０－０８—０９

作者简介：杜广香（１９８７一），女。在读硕士生。Ｅ－ｍａｉｌ：１０３５４０３６２９

＠ｑｑ．ｔｏｍ头碱对照品在４１２—４１４哪处有最大吸收峰，故可选４１２ｎｍ为其检测波长。２．２乌头碱标准曲线分别取０、１．０、２．０、４．０、６．０、８．０ｍＬ溶液于２５ｍＬ磨

口试管中，氯仿定容。分别加入０．５％溴甲酚绿显色剂２．０

ｍＬ、ｐＨ４．０的氯氧化钠一邻苯二甲酸氢钾缓冲液６ｍＬ，密通讯作者：浦跃武（１９６４一），男。博士，副教授。Ｅ－ｍａｉｌ：９９６１２３＠ｓｅｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ

万方数据

塞振摇２ｒａｉｎ．倒入６０ｍＬ分液漏斗中，静置ｌｈ，使水层和氯仿层分清后。将分出的氯仿层用脱脂棉过滤，在４１２１１１１３波长处测定吸光度。以测得的吸光度为纵坐标，生物碱

含量为横坐标．作标准曲线，，计算得回归方程：Ａ＝２．７８５５Ｃ—

Ｏ．０４６，月２＝ｏ．９９９９，表明乌头碱含量在４０—３２０“ｇ范围内，浓度与吸光度线性关系良好。２．３缓冲液ｐｌ－Ｉ值的选择

精密吸取样品溶液１．０ｍＬ，分别加入ｐＨ值为３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０的氢氧化钠一邻苯二甲酸氢钾缓冲液５ｍＬ及其配制的Ｏ．５％溴甲酚绿溶液４ｍＬ，其余操作同标准曲线的绘制，得缓冲液ｐＨ值对玛咖总生物碱提取率的影响结果。结果（图１）表明，玛咖生物碱与溴甲酚绿形成的离子对在ｐＨ３．５—５．Ｏ氢氧化钠一邻苯二甲酸

氢钾缓冲溶液中吸光值稳定，且当ｐＨ值为４．０时吸光值

最大。故选用ｐＨ４．０的缓冲溶液。

缓冲液ｐＨ

圈１

缓冲液ＤＨ值对玛咖总生物碱提取率的影响

２．４缓冲液用量的选择

精密吸取样品溶液１．０ｍＬ．分别加入ｐＨ４．０的氧氧化钠一邻苯二甲＋酸氢钾缓冲液３、４、５、６、７、８ｍＬ及其配置的０．５％溴甲酚绿溶液５ｍＬ．其余操作同标准曲线的绘

制。结果（图２）表明。当缓冲液的用量为６ｍＬ时，吸光度最大，故选用缓冲液加入量６ｍＬ为宜。

ｊ四

芸督

缓冲液用量（ｍＬ）

图２缓冲液用■对玛咖总生物碱提取率的影响

２．５Ｏ．５％溴甲酚绿显色剂的用量选择

精密吸取样品溶液１．０ｍＬ，加入ｐＨ４．０的氢氧化钠一

邻苯二甲酸氢钾缓冲液６ｍＬ及其配置的０．５％溴甲酚绿显色剂ｌ、２、３、４、５ｍＬ，其余操作同标准曲线的绘制。结果（图３）表明，当显色剂的用量为２ｍＬ时，吸光度最大，故显色剂的用量以２ｍＬ为宜。２．６溶液振摇时间的选择

精密吸取样品溶液１．０ｍＬ，加入ｐＨ４．０的氢氧化钠一

邻苯二甲酸氢钾缓冲液６ｍＬ及其配置的Ｏ．５％溴甲酚绿显色剂２ｍＬ。样品与溴甲酚绿形成的离子对用氯仿萃取

万方数据

１４３

趔簧餐

显色剂用鼠（ｍＩ．）

图３显色剂用量对玛咖总生物碱提取率的影响

时，振摇时间分别设为ｌ、２、３、４ｍｉｎ。振摇时间对玛咖总生物碱提取率的影响结果见图４。结果表明，吸光值无明

显变化，故可选择振摇时间为２

ｒａｉｎ。

趔梨餐

振摇时间（ｒａｉｎ）

图４振摇时间对玛咖总生物碱提取率的影响

２．７氯仿萃取放置时间的选择

样品与溴甲酚绿所形成的离子对用氯仿萃取后。于分

液漏斗中放置５０—１００ｍｉｎ。试验结果表明，吸光值稳定。故放置时间选用６０ｍｉｎ为宜。２．８精密度试验

取同一比色样品．采用同样方法连续测定５次，其吸

光值分别为０．４７０８、０．４７２２、０．４７３２、０．４７４５、０．４７２９，ＲＳＤ＝０．２９％，表明仪器精密度符合要求。２．９稳定性试验

分别精密吸取对照品溶液和样品溶液各１．０ｍＬ．分别按标准曲线的绘制项下操作，每隔１ｈ测其吸光值。结

果表明二者在８ｈ内吸收值稳定，ＲＳＤ分别为０．５８％、

０．６４％。

２．１０重复性试验

取同批供试品溶液５份。按标准曲线项下规定的方法操作，结果ＲＳＤ为０．５４％，ｎ＝５，表明重复性良好。

２．１ｌ加样回收率试验

采用加样回收法，精密称取５份玛咖粉末各５．０ｇ．分别加入乌头碱对照品５ｍｇ，按标准曲线项下规定的方法

操作，结果（表１）表明，其平均回收率为９５．８６％，ＲＳＤ为

０．９３％。ｎ＝５。

表１加样回收率的测定

１４４

２．１２样品含量测定

精密称取玛咖粉末５．０ｇ，按１．２．１方法制备供试品溶液。按标准曲线项下规定的方法操作，结果表明，每克样品中所含的生物碱含量为４．６５０８

ｍｇ。

硫酸钠不足时，萃取液中的水分不能除尽：当无水硫酸钠

过量时，则会对离子对产生吸附，从而影响吸光值的测定。而本研究则是采用脱脂棉法去除。从而避免了上述情况。３．５本试验中所采用的酸性染料比色法的测定结果与相

３结论与讨论

通过本试验可知，在用酸性染料比色法测定玛咖中总

关文献中报道的采用滴定法的测定结果１３，１３１有一定的差异，

这可能是因为玛咖生物碱中的部分生物碱对两种方法的响应不一致．这种酸性染料比色法与滴定法之间的差异是比较常见的。

参考文献：

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生物碱含量时，采用以下显色条件可得满意效果：在乌头

碱４０～３２０斗ｇ范围内，选用ｐＨ４．０的氢氧化钠一邻苯二甲酸氢钾缓冲液６ｍＬ，及用其配置的Ｏ．５％溴甲酚绿２ｍＬ，振摇２ｒａｉｎ。于６０ｍＬ分液漏斗中静置６０ｒａｉｎ后于４１２ａｍ波长处检测。测得玛咖中总生物碱含量为４．６５０８ｍｒ，／

ｇ。

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３．１在本研究中，首先用酸性滤液调节ｐＨ至２～３，此时生物碱以生物碱盐的形式存在于水中。氯仿等体积萃取３次．其目的是去除酸性滤液中的脂肪酸、色素及鞣质类等

杂质；再用５

ｍｏ儿ＮａＯＨ调节ｐＨ值至９—１０，在碱性条

件下，生物碱盐与碱作用转化成游离的牛物碱［５１，它们较易溶于有机溶剂。由前期预试验可知，玛咖中的生物碱主要为非水溶性生物碱．可用有机溶剂氯仿对其萃取。

３．２

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６９３．

由于玛咖总生物碱中组分众多，而各组分的研究相对

缺乏，目前已知的几类重要生物碱的相对含量也很低１６－７１，无

法得到其标准品。乌头碱具有典型的生物碱特性，当玛咖总

【７】余龙江，金文闻．玛咖有效成分提取方法【Ｐｌ中国专利：０１１３８３３０５，

２００ｌ—１２—２０．

生物碱与酸性染料形成离子对时。用氯仿萃取，萃取液在

４１２ａｍ处有最大吸收峰１８１．这与乌头碱的最大吸收峰位相

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同。故选择乌头碱作为对照品较为适宜。

３３当用酸性染料比色法测定生物碱含量时，也常采用溴百里香酚蓝试剂作为显色剂…１Ｉ。但通过预试验比较发

现．以溴百里香酚蓝作为显色剂时，吸光值稳定性较溴甲酚绿差．故本试验中采用溴甲酚绿为显色剂。

３．４有文献报道．在以酸性染料比色法测定总生物碱时，

常用无水硫酸钠颗粒作为吸水剂［３１，以去除萃取液中的水分．此法的缺点是要严格控制无水硫酸钠的用量。当无水

●ｋｊｋ■｝，ｉ睁—譬，ｋ坐坐业—蕾｝业坐囊坐坐业坐坐坐坐坐业坐业■｝—｝■｝坐坐■｝誓｝ｊｋ■｝，｜■ｊｊ‘业赡赡捌｝■｝坐赡业‘誓｝坐ｊｊ譬ｊｋ（上接第１２７页）

４５．１６％提高到５３．９４％。提高率为１９．４４％。

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ｒｉｃｅ

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ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ

ｆＲｉｃｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

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ｏｆ

ｓｏｙｂｅａｎ

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Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ

ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ

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ｐｌａｓｍａ

ｅｘｃｒｅｔｉｏｎｉｎ

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万方数据

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酸性染料比色测定玛咖总生物碱含量的条件考察

作者：

作者单位：

刊名：

英文刊名：

年，卷(期)：杜广香， 浦跃武， DU Guang-xiang， PU Yue-wu华南理工大学生物科学与工程学院,广东,广州,510006广东农业科学GUANGDONG AGRICULTURAL SCIENCES2011,38(5)

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引用本文格式：杜广香.浦跃武.DU Guang-xiang.PU Yue-wu 酸性染料比色测定玛咖总生物碱含量的条件考察[期刊论文]-广东农业科学 2011(5)