甘肃省马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定

2011年6月

第3期65~69甘 肃 农 业 大 学 学 报JOURNALOFGANSUAGRICULTURALUNIVERSITY第46卷双月刊

甘肃省马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定

成兰芳1,张文解2,李惠霞1,王生荣1

(1.甘肃农业大学草业学院植物病理系,甘肃兰州 730070;2.甘肃省植保植检站,甘肃兰州 730000)

摘要:对2009年采自甘肃省17个地点的63个马铃薯晚疫病菌株进行生理小种类型的鉴定.结果表明:小种

4.6.7.11的出现频率达28.57%,出现频率最高,分布最广,是2009年甘肃省马铃薯晚疫病菌株的优势小种.而小种1.3.4.5.6.7.8.10.11含有的毒力基因数目最多,单毒力基因的生理小种只有4号.从生理小种的毒力基因组成来看,毒力基因vir1、vir4、vir6、vir7出现频率较高,均达到所鉴定菌种的50%以上,没有发现vir2、vir9毒力基因.

关键词:马铃薯晚疫病;生理小种;鉴定

中图分类号:S435.32 文献标识码:A 文章编号:1003-4315(2011)03-0065-05

IdentificationofphysiologicalracesonPhytophthorainfestans

isolatedfrompotatoinGansuProvince

CHENGLan-fang,ZHANGWen-jie,LIHu-ixia,WANGSheng-rong

PlantProtectionandQuarantineofGansuProvince,Lanzhou730000,China)1211(1.CollegeofPrataculture,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2.Stationof

Abstract:SixtythreephysiologicalracesofPhytophthorainfestansisolatedfrom17potatoproductionareasinGansuProvincewereidentifiedin2009.Theresultsshowedthatrace4.6.7.11hadthemostfre-quentanddistribution,thefrequencyreached28.57%.Race1.3.4.5.6.7.8.10.11hadthemostvirulentgenes.Race4onlyhadasimplevirulentgene.Thevirulentgenesvir1,vir4,vir6andvir7occurredmuchfrequently(over50%)anddistributedwidely.Thevirulentgenesvir2andvir9didnotfoundinGansuProvince.

Keywords:Phytophthorainfestans;physiologicalrace;identification

马铃薯是世界第四大粮食作物,仅次于水稻、小

麦和玉米,但是由致病疫霉菌(Phytophthorainfes-

tans(Mont.)deBary.)引起的马铃薯晚疫病已成

为马铃薯生产中最严重的病害[1].目前,全世界每年

因晚疫病造成的马铃薯产量损失折合经济价值已经

超过20亿美元[2],如果包括为防治晚疫病所需要的

药剂等费用在内,大约每年为50亿美元[3].据联合

国粮农组织(FAO)统计,我国每年因晚疫病造成的

损失约2亿美元[4].FAO在1996年的年度报告中认为,马铃薯晚疫病的危害性、防治难度及对社会造成的影响已超过了水稻稻瘟病及小麦锈病,被视为国际第一大作物病害[5].甘肃省马铃薯栽培面积大,气候冷凉,后期雨量充沛,晚疫病常年发生严重,给当地造成很大的经济损失.目前,世界各国对晚疫病的防治主要以培育抗病品种及采用化学药剂防治为主.而研究马铃薯晚疫病菌生理小种及其毒力基因的组成与分布,确定优势小种和强毒力小种的类型,监测马铃薯晚疫病作者简介:成兰芳(1984-),女,硕士研究生,主要从事马铃薯晚疫病研究.E-mail:chenglanfang.happy@http://wendang.chazidian.com

通信作者:王生荣,男,教授,博士生导师,主要从事真菌分类及其病害研究.E-mail:wangsr@http://wendang.chazidian.com

基金项目:甘肃省植保植检站专项;国家科技支撑计划(2006BAD21B05);国家公益性行业(农业)科研专项经费项目(200803024).

收稿日期:2010-09-26;修回日期:2010-12-17

66甘肃农业大学学报

2011年

菌的群体结构变化,对于有针对性的开展马铃薯抗病育种及抗病品种的合理布局,提高马铃薯产业的市场竞争力有重要意义.目前,国内对马铃薯晚疫病菌生理小种的研究已有很多报道,黄河等[7]报道了1962年~1967年采集的河北省张家口市、黑龙江省、甘肃省、山西省、内蒙古自治区、青海省和北京市等省市地区的马铃薯晚疫病菌菌株的生理小种;刘晓鹏等

[8]

[6]

挑小块培养基,接种在黑麦培养基上.把培养基放在16~18e黑暗的生化培养箱中3~4d后,从培养基的侧面灰白色霉层处挑取菌丝和少许培养基于另一些培养基中,并放在16~18e黑暗的生化培养箱中培养.

1.2 鉴别寄主的培育

统一鉴别寄主(含DR1~DR11)由中国农业科学院蔬菜花卉研究所马铃薯课题组提供,鉴别寄主均为无菌保存的试管苗.用MS培养基扩繁寄主,试管苗移植20d后,再将其转接到1/2MS培养基扩繁,促使其茎杆粗壮,20d左右将其移栽至以蛭石为基质的花盆中,先用清水浇1周,然后第1月和第2月分别用不同的营养液浇灌,在温室温度18~25e、自然光照条件下培养,待幼苗长到7~10个复叶时取植株中部复叶,进行接种鉴定.1.3 生理小种的鉴定

1.3.1 鉴定方法 从采自甘肃省马铃薯晚疫病标本分离纯化的菌株中,选取代表性的菌株进行单孢分离纯化用于测定生理小种.菌株在黑麦培养基上培养10d,将其移至表面消毒的新鲜薯片上,恢复其致病力并产生更多孢子囊,4~7d后,从薯片上挑取菌丝放入3mL的灭菌水中,配成孢子囊悬浮液,用网筛过滤.血球计数器计数,配成孢子囊2000~3000个#mL-1的悬浮液,放在4e下30min诱发游动孢子产生,备用.

1.3.2 接种鉴定 采用离体叶片接种法:分别将栽培的鉴别寄主中部复叶的离体小叶片背面朝上,置于用1%的水琼脂培养基上保湿,每个培养皿3~4片小叶,重复3次.接种事先准备好的游动孢子液,用微量移液器吸取20LL接种在叶脉侧面.放于17e黑暗培养过夜,第2d将叶片翻转,用封口膜封好,17~20e培养,第4d观察记录感病情况,第7~10d观察菌丝体及孢子囊形成.用低倍显微镜观察症状情况,产生孢子囊的为感病(S),不产生孢子囊的为抗病(R).

1.3.3 马铃薯晚疫病菌生理小种的命名方法 准确确定菌株是否有毒力之后,根据Black等

[11]

报道了湖北省恩施市马铃薯晚疫病菌的

生理小种组成;杨艳丽等[9]报道了云南省12个县市的马铃薯晚疫病菌生理小种的组成及分布情况;朱杰华等[10]报道了1997年~1998年采自河北省(围场县、康保县)、云南省(曲靖市、楚雄市、大理市、祥云市、宣威市、陆良市)、重庆市万县、四川省西昌市、内蒙古自治区呼伦贝尔盟等地区的马铃薯晚疫病菌的生理小种组成.从鉴定结果看,生理小种组成复杂且随着时间、地点有所变化.鉴于此,本研究于2009年广泛采集甘肃省部分地区马铃薯晚疫病菌标样,并进行生理小种鉴定,以期为马铃薯晚疫病的防治提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 病株的采集分离和菌种的保存

2009年从甘肃省康乐县、和政县、东乡县、临夏县、定西市安定区、陇西县、渭源县、庆阳市、庄浪县、永登县、临洮县、秦安县、榆中县、永靖县等地区马铃薯晚疫病发生地采集马铃薯晚疫病病叶共63株,选择植株上叶片发病且有典型症状的病叶随机采3~4片,记录采集地点和日期,带回实验室,分离保存.1.1.1 黑麦培养基的制备 称取50~60g黑麦,用蒸馏水浸泡24~36h,直到大部分黑麦都发芽露白,高压灭菌30min,过滤.新鲜西红柿汁100mL煮沸,加0.4gCaCO3,过滤.2种滤液混合,加蒸馏水补足1000mL,琼脂15~16g,灭菌.

1.1.2 病原菌的分离纯化 将具有典型症状的病叶经自来水冲洗,洗去病叶表面的污物,再用灭菌水冲洗2遍,放在干净的滤纸上吸去水.用灭菌解剖剪剪去受害严重的部分,取病健交界的叶片5cm@5cm左右,背面朝上置于灭菌的1.6%~2.0%琼脂培养基上保湿培养,24h后,叶片背面长出孢囊梗,,提出

的马铃薯晚疫病菌生理小种国际命名方案,确定生理小种的名称.根据晚疫病菌在11个鉴别寄主上引

第3期成兰芳等:甘肃省马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定67

2 结果与分析

2.1 2009年甘肃省马铃薯晚疫病菌生理小种的类型

对63个马铃薯晚疫病菌株进行鉴定,得到16个生理小种(表1),其中,康乐县2个,和政县1个,东乡县5个,临夏县2个,定西市安定区3个,陇西县5个,渭源县3个,庆阳市3个,庄浪县2个,永登县3个,临洮县2个,秦安县7个,榆中县3个,永靖县2个.从全省各生理小种的组成来看,复合型毒力

基因生理小种占据了主导地位,单毒力基因的生理小种数量比较少.秦安县出现了含有毒力基因数目最多的小种1.3.4.5.6.7.8.10.11,携带9个毒力基因,但出现频率很低,仅为3.17%.小种4.6.7.11出现频率最高,为28.57%,且分布较多,是2009年甘肃省马铃薯晚疫病菌的优势小种;其次为小种1.4.6.7.11,出现频率为15.87%;含单毒力基因的小种4,出现频率为3.17%,分布在永靖县阳平乡和秦安县王铺乡(表2、图1).

表1 2009年甘肃省马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定结果

Tab.1 IdentificationofphysiologicalraceofP.infestansisolatedfrompotatoinGansuProvincein2009菌株代号CT-4

CT-6CT-7CT-CDT-2DT-4PZ-BPZ-1PZ-2PZ-3PZ-4PZ-11TQ-DTQ-1TQ-HTJ-2TJ-3TJ-5TJ-6CZ-1CZ-2CZ-3CZ-7FX-7FX-9HC-2HC-3HC-5HC-11PY-3PY-5PY-7ZH-1ZH-2ZH-4QC-1QC-3QC-4QC-5采集地点康乐县草滩乡

康乐县草滩乡康乐县草滩乡康乐县草滩乡和政县吊滩乡和政县吊滩乡东乡县坪庄乡东乡县坪庄乡东乡县坪庄乡东乡县坪庄乡东乡县坪庄乡东乡县坪庄乡临夏县土桥镇临夏县土桥镇临夏县土桥镇安定区团结镇安定区团结镇安定区团结镇安定区团结镇陇西县菜子镇陇西县菜子镇陇西县菜子镇陇西县菜子镇陇西县福兴镇陇西县福兴镇渭源县会川镇渭源县会川镇渭源县会川镇渭源县会川镇庆阳市彭原乡庆阳市彭原乡庆阳市彭原乡庄浪县郑河乡庄浪县郑河乡庄浪县郑河乡永登县秦川乡永登县秦川乡永登县秦川乡永登县秦川乡生理小种类型1.4.6.7.111.4.6.7.114.6.7.111.4.6.7.111.4.6.71.4.6.71.44.6.7.114.7.111.4.7.111.4.6.71.4.6.71.3.4.6.71.3.4.6.71.4

1.4.6.7.10.111.3.4.114.6.7.114.6.7.111.4.6.7.111.3.4.5.6.7.111.4.5.6.7.111.3.4.114.6.7.114.6.7.111.4.6.7.10.114.6.7.111.3.44.6.7.111.4.7.111.4

1.4.5.6.7.8.10.11

1.4.6.7.104.6.7.114.6.7.111.4.6.7.111.4.6.7.114.6.7.111.3.4

68

续表1菌株代号TY-37XK-1XK-2XK-4XK-6XK-7WP-4WP-6WP-7WP-17WP-15WP-23GJ-4GJ-5GJ-12GJ-13GJ-16XL-3XL-4XL-6YP-1YP-2YP-3

甘肃农业大学学报

2011年

采集地点临洮县洮阳镇

临洮县峡口乡临洮县峡口乡临洮县峡口乡临洮县峡口乡临洮县峡口乡秦安县王铺乡秦安县王铺乡秦安县王铺乡秦安县王铺乡秦安县王铺乡秦安县王铺乡秦安县郭加镇秦安县郭加镇秦安县郭加镇秦安县郭加镇秦安县郭加镇榆中县兴隆山榆中县兴隆山榆中县兴隆山永靖县阳平乡永靖县阳平乡永靖县阳平乡

生理小种类型4.6.7.114.6.7.114.6.7.111.4.6.7.10.114.6.7.114.6.7.111.4.7.111.4.6.7.11

44.6.7.11

1.3.4.5.6.7.8.10.11

1.4.6.7.10.111.4.6.7.10.111.4.6.7.10.111.4.6.7.111.4.6.7.11

1.3.4.5.6.7.8.10.11

3.4.6.71.3.4.6.71.44

1.4.6.7.101.4.6.7.10

表2 2009年甘肃省不同地区马铃薯晚疫病生理小种及其出现频率

Tab.2 PhysiologicalraceanditsfrequencyofP.infestansindifferentpartsofGansuProvincein2009小种类型1.3.4.5.6.7.8.10.111.4.5.6.7.8.10.111.4.6.7.10.111.3.4.5.6.7.111.4.6.7.111.4.6.7.101.3.4.6.71.3.4.111.4.6.71.4.7.114.6.7.113.4.6.74.7.111.3.41.44

数目216110332431811242

频率/%3.171.599.521.5915.874.764.763.176.354.7628.571.591.593.176.353.17

出现地点秦安县

庆阳市

秦安县、临洮县、渭源县、安定区陇西县秦安县、永登县、陇西县、康乐县、庄浪县

庄浪县、永靖县

榆中县、临夏县安定区、陇西县东乡县、和政县秦安县、庆阳市、东乡县

陇西县、秦安县、临洮县、永登县、庄浪县、

陇西县、渭源县、东乡县、康乐县

榆中县

东乡县

永登县、渭源县

东乡县、榆中县、庆阳市、临夏县

永靖县、秦安县

2.2 不同地点马铃薯晚疫病菌毒力基因的出现频率与分布

17个地点普遍存在马铃薯晚疫病菌毒力基因vir1、vir4、vir6和vir7,在4个毒力基因中,vir4、vir6

和vir7出现频率最高,平均达90%以上;其次为vir1,出现频率达80%;vir11出现频率为70%;vir5出现频率为30%;vir3、vir8和vir10在各个地点出现较少,频率为10%左右;vir2和vir9在17个地点

第3期成兰芳等:

甘肃省马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定69

甘肃省没有出现能够克服R2和R9抗性基因的小种,因此,在马铃薯生产中,甘肃省各马铃薯产区短期内可以针对性的使用含有R2和R9抗性基因的马铃薯品种,来防止晚疫病的发生.同时在抗晚疫病育种方面,可以考虑培育含R2和R9抗性基因马铃薯新品种,对延缓和减轻晚疫病的发生,具有一定的实际意义.

图1 2009年甘肃省不同马铃薯晚疫病

生理小种出现频率

Fig.1 ThefrequencyofphysiologicalraceofP.infestans

inGansuProvincein2009

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(责任编辑 许涛)

均未出现.此次鉴定结果表明,定西市安定区和秦安县的马铃薯晚疫病菌生理小种组成最为复杂,分别含有9个和7个毒力基因的复合性小种出现;陇西县福兴镇的小种组成较为简单,仅含有3个毒力基因;其他地点出现的复合性小种也各有不同.

3 讨论与结论

本研究鉴定出的马铃薯晚疫病菌的生理小种比黄河等

[7]

报道的甘肃省晚疫病菌生理小种组成要复

杂得多,其中一个原因是目前国际上鉴定生理小种的鉴别寄主已由原来的含有4个基因型(R1、R2、R3、R4)品种组成,变为现在的由11个基因型(R1~R11)组成,利用这些基因的各种组合,可以鉴定出更多的生理小种,同时也说明随着含有不同抗性基因的抗病品种的推广,病原菌中新的致病基因、新的生理小种在不断产生.早期的生理小种组成都比较简单,经过近40年的发展,目前世界各国的晚疫病菌生理小种的毒力基因组成日趋复杂.从分布来看,马铃薯主产区的生理小种类型较多,而且很复杂;而非主产区的生理小种类型较少,相对简单.韩淼等[12]在2007年~2008年采集甘肃省马铃薯晚疫病菌菌株共49株,鉴定出27个生理小种.本研究在2009年采集甘肃省马铃薯晚疫病菌菌株共63株,鉴定出16个生理小种.本研究结果说明,晚疫病菌生理小种的进一步分化,尤其是复合型生理小种的增加,致使马铃薯抗晚疫病育种更加艰难.

从组成生理小种的毒力基因类型来看,2009年