十一种市售流感病毒疫苗成品的比较和研究

十一种市售流感病毒疫苗成品的比较和研究

十一种市售流感病毒疫苗成品的比较和研究

祁骥，田文莉，高燕燕（天士力金纳生物技术(天津)有限公司 天津 300410）

摘要：目的 对国内市售流感病毒疫苗产品进行研究和比较。 方法 对十一种市售流感病毒疫苗分别进行蛋白含量、游离甲醛含量、卵清蛋白含量以及内毒素检测，并用20cm×20cm凝胶进行非还原及还原SDS-PAGE。结果 十一种疫苗的所有检测项目均符合规定，但疫苗的质量有所差别。 结论 所测试的流感病毒疫苗产品均具有较好的安全性和有效性，亚单位疫苗质量优于裂解疫苗。

关键词：流感病毒疫苗；蛋白含量；游离甲醛；卵清蛋白；内毒素；SDS-PAGE

Comparison and Research of Eleven Commercially Available Influenza Virus Vaccines

QI Ji, TIAN Wen-li, GAO Yan-yan (Tasly & Jenner(Tianjin) Co., Ltd, Tianjin 300410, China)

ABSTRACT: OBJECTIVE To study and compare domestic commercial influenza virus vaccines. METHODS 11 commercially available influenza vaccines were tested for protein content, free formaldehyde content, ovalbumin content, endotoxin content, as well as non-reduced and reduces 20cm×20cm SDS-PAGE. RESULTS All the test results of 11 vaccines were within the standards, however, the quality of vaccines were varied. CONCLUSION All the tested vaccines were in good safety and efficacy, while subunit vaccines were better than split virion vaccines.

KEY WORDS: Influenza vaccine; Protein Content; Free Formaldehyde; Ovalbumin; Endotoxin; SDS-PAGE

自从1932年流行性感冒病毒首次在实验室中分离被分离出来，人们对这种传染性疾病的认识就开始逐渐深入。研究表明流感病毒的流行具有一下特点：首先，流感易在冬季和寒冷天气流行；其次，常首发于东半球或南半球，随后蔓延至欧洲和北美；第三，当流感病毒发生抗原结构的变异后易引发流行。流感病毒主要通过呼吸道飞沫和接触传播，人类对流感病毒普遍易感，体弱者易发生继发性病毒感染，对公众健康危害性大。目前，针对流感的传播，免疫接种是最有效的预防方法[1-6]。

目前市售的流感病毒疫苗主要有三类：全病毒灭活疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗。全病毒灭活疫苗成本低，但是接种副反应发生率较高。裂解疫苗虽较之全病毒灭活疫苗具有较低的接种副反应，但病毒所包含的其他杂质蛋白经过裂解仍会导致一定程度的副反应。亚单位型流感疫苗的有效成分是高纯度的抗原组分——血凝素（Haemagglutinin, HA），几乎不含杂质蛋白，在最大程度上避免了接种副反应，临床试用已证实其免疫效果与裂解疫苗相同，而安全性明显优于全病毒灭活疫苗和裂解疫苗[7]。

为了保证流感病毒疫苗的安全性和有效性，《中国药典》三部中对流感病毒裂解疫苗成品的各个检作者简介：祁骥，女，硕士研究生 

定项目及其合格标准有着详细、明确的规定。本文对十一种市售流感病毒疫苗中的重要项目进行了检测并进行了SDS-PAGE分析。

1

材料与方法

十种市售2011年度流感病毒疫苗成品（其中进口产品3种，国产产品7种），孚洛克（流感病毒亚单位疫苗，批号20110801）由天士力金纳生物技术(天津)有限公司生产，详细资料见表1。

表1 十一种市售流感病毒疫苗

Tab. 1 11 Commercially available Influenza Virus Vaccines

1.2 主要试剂

酚试剂（Sigma），卵清蛋白ELISA试剂盒（Serazym® Ovalbumin ELISA, E-041a），鲎试剂（0.25EU ml-1，湛江安度斯生物有限公司），SDS-PAGE低分子量蛋白质Marker（中国科学院上海生物化学研究所监制），蛋白质分子量标准（宽）（大连宝生物，D532S）。 1.3 蛋白含量测定

十一种疫苗成品分别按照《中国药典》三部 附1.1 十一种流感病毒疫苗成品

研究方向：生物制品的质量控制 Tel：(022)86342476  E‐mail：qiji455@http://wendang.chazidian.com 

十一种市售流感病毒疫苗成品的比较和研究

录 Ⅵ B第二法进行检测。 1.4 游离甲醛含量

十一种疫苗成品分别依照田文莉等的方法采取酚试剂分光光度法进行检测，在5ml反应体系中500μl 样本与2 ml 0.85mg ml-1酚试剂于35 ℃反应10min后，加入0.1mol L-1盐酸2ml和1%硫酸铁铵0.5ml，35℃反应20min，测定629nm处的吸收波长；以甲醛标准溶液同法操作作为标准曲线[8]。 1.5 卵清蛋白含量

使用卵清蛋白ELISA试剂盒对十一种疫苗成品进行检测。 1.6 内毒素检测

十一种疫苗成品分别按照《中国药典》三部 附录Ⅻ E凝胶限度试验进行检测。 1.7 SDS-PAGE

样品处理：分别取十一种疫苗成品80μL，加入1μl 100mg ml-1壬苯醇醚-9，混匀后室温静置2小时，每个样品制备两份，一份加入5×还原型上样缓冲液20μl，另一份5×非还原型上样缓冲液20μl，混匀后100℃水浴5 min，冷却至室温后混匀。 凝胶电泳：采用Bio-Rad PROTEAN Ⅱ xi电泳装置进行实验，凝胶尺寸20cm×20cm。聚丙烯酰胺电泳凝胶（丙烯酰胺单体：N,N’-甲叉双丙烯酰胺单体为37.5:1），浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%，所有处理后的样品全部上样；浓缩胶16mA，分离胶24mA，恒流电泳。待染料迁移至凝胶边缘时终止电泳，取出凝胶进行考马斯亮蓝染色并成像。 2

结果

本文分别对十一种流感病毒亚单位疫苗进行了蛋白含量、内毒素、游离甲醛和卵清蛋白含量的检测，检测结果见表2。因各厂家所采用的毒种型别不尽相同，本文无法对血凝素含量进行测定和比较。 表2 十一种流感病毒疫苗的检测结果

Tab. 2 Test results of 11 Influenza Virus Vaccines

疫苗中的蛋白由血凝素和其他杂蛋白构成，杂蛋白、甲醛、卵清蛋白含量过高均可能引起疫苗注射后的副反应，《中国药典》三部中规定裂解疫苗的蛋白含量应不高于400μg ml-1，并不得超过疫苗血凝素总含量的4.5倍。本试验中的8个裂解疫苗和3个亚单位疫苗的蛋白含量平均值分别为227.0μg ml-1和203.7μg ml-1。大致上看。亚单位疫苗的蛋白含量略低于裂解疫苗，但两者差别并不明显。

《中国药典》三部中给出的裂解疫苗游离甲醛含量的测定方法是品红亚硫酸法，此法最低检测限仅为25μg ml-1。酚试剂分光光度法线性范围为0.1~5μg ml-1，更适合甲醛含量较微量的疫苗产品的检测需要。而由于生产工艺的不同，亚单位疫苗的游离甲醛含量平均值为1.27μg ml-1明显低于裂所有疫苗的游离甲醛含量均解疫苗的6.65μg ml-1。大大低于《中国药典》三部裂解疫苗应不高于50μg ml-1的标准。

卵清蛋白含量《中国药典》三部规定裂解疫苗采用酶联免疫法检测，卵清蛋白含量不超过500ng ml-1，十一种市售疫苗均符合规定。

内毒素的含量直接关系到疫苗的安全性，从内毒素含量的测定结果看，十一种疫苗没有显著的差别，均优于《中国药典》三部中关于裂解疫苗应小于20EU ml-1的规定。

2.2 SDS-PAGE

由十一种疫苗的非还原SDS-PAGE（见图1）可以看出，所有疫苗产品均在200kD上下的位置有多条清晰的血凝素寡聚体条带，充分展现了所有市售疫苗的有效成分。

图1 十一种流感疫苗的非还原SDS-PAGE

Fig.1 Non-reduced SDS-PAGE for 11 Influenza Virus Vaccines

2.1 各种主要含量检测

由表1可知，疫苗3、4、8的流感病毒型别是一致的，而疫苗3的电泳条带中寡聚体含量明显多于疫苗4和疫苗8，儿降解的血凝素（或杂蛋白）的含量明显少于疫苗4、8。疫苗8在20~30kD之间还有一条明显的杂质条带，是其他疫苗中均不具有的。就蛋白质组成来说，疫苗3的质量优于疫苗4和疫苗8。

疫苗5和疫苗7的流感病毒型别一致，电泳条带除蛋白浓度不同外，相差无几。

而以疫苗1和疫苗9为例，两者型别一致，但疫苗1是裂解疫苗，疫苗9是亚单位疫苗。疫苗9中不含有疫苗1中近50kD的条带，说明该条带很可能是流感病毒核蛋白或M蛋白等杂质。疫苗9电泳条带较少，说明血凝素纯度比疫苗1更高。 图2 十一种流感疫苗的还原SDS-PAGE

Vaccines

图2是十一种疫苗的还原电泳，所有的血凝素均已被还原成两个亚基，非还原电泳中清晰可见的血凝素寡聚体和单体均已消失。

十一种市售流感病毒疫苗成品的比较和研究

因每个疫苗中均含有三种型别的血凝素，故而无法一一分辨每一个亚基的电泳条带。但疫苗1中小于20kD的条带不是血凝素的亚基，为杂蛋白。

3 讨论

本文通过对市售的十一种流感病毒疫苗部分项目进行的检测可以看出目前国内市场上的流感病毒疫苗均具有较好的安全性和有效性，但各厂家生产的疫苗产品质量存在差异。从疫苗的类型上看，亚单位疫苗因其生产工艺中对血凝素的纯化，除去了绝大部分不必要的杂质蛋白[9]，因此纯度更高、安全性更好，是未来的应用中具有更好的使用前景。

参考文献：

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HUEBNER R C, HARMON M W. Influenza virus subunit conjugates[P]. WO9603145

十一种市售流感病毒疫苗成品的比较和研究

附表

表1 十一种市售流感病毒疫苗

Tab. 1 11 Commercially available Influenza Virus Vaccines

Influenza Virus Vaccine No.1 (Import)

Category Split Virion

Type/Subtype

Lot No.

H1N1 H3N2 B A/California/7/2009 （NYMC X-181)

A/Perth/16/2009(A/Victoria/210/2009 （NYMC X-187)

B/Brisbane/60/2008 YFLUA645AAB/Brisbane/60/2008 FL20110714

A/Perth/16/2009(A/Victoria

No.2 Split Virion A/California/7/2009

/210/2009）

No.3 Split Virion A/California/7/2009 A/Victoria/210/2009 B/Brisbane/60/2008 201106007 No.4 Split Virion A/California/7/2009 A/Victoria/210/2009 B/Brisbane/60/2008 201106032 A/California/7/2009 No.5 Split Virion

（NYMC X-179A）A/California/7/2009

No.6 Split Virion

（NYMC X-179A）A/California/7/2009

No.7 Split Virion

（NYMC X-179A）

A/Perth/16/2009(A/Victoria/210/2009 （NYMC X-187)A/Perth/16/2009(A/Victoria/210/2009 （NYMC X-183)A/Perth/16/2009(A/Victoria/210/2009 （NYMC X-187)

B/Brisbane/60/2008 20110740 B/Brisbane/60/2008 201104B04 B/Brisbane/60/2008 20110613-02

No.8 Split Virion A/California/7/2009 A/Victoria/210/2009 B/Brisbane/60/2008 201105009-1 No.9 (Import) No.10 (Import) No.11

FLU-K(孚洛克)

Subunit Subunit

A/California/7/2009 （NYMC X-181) A/California/7/2009 （NYMC X-181)

A/Perth/16/2009(A/Victoria/210/2009 （NYMC X-187)A/Perth/16/2009(A/Victoria/210/2009 （NYMC X-187)

B/Brisbane/60/2008 X08 B/Brisbane/60/2008（NYMC BX-35）

111502

A/Perth/16/2009(A/Victoria

Subunit A/California/7/2009

/210/2009 （NYMC X-187)

B/Brisbane/60/2008 20110801

表2 十一种流感病毒疫苗的检测结果

Tab. 2 Test results of 11 Influenza Virus Vaccines

Influenza Virus Vaccine

No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 No.7 No.8 No.9 No.10 No.11

Protein Contents （μg ml-1）

Free Formaldehyde Contents

（μg ml-1）

Ovalbumin Contents

(ng ml-1)

Endotoxin Contents

(EU ml-1)

276 2.24 240 27.52 221 0.87 270 16.29 208 0.88 228 2.89 169 0.57 204 1.90 243 1.82 177 1.53 191 0.45

14 <2.5 90 <2.5 72 <2.5 6

<5

8 <2.5 36 <2.5 73 <2.5 52 <2.5 55 <5 298 <2.5 110 <2.5

十一种市售流感病毒疫苗成品的比较和研究

附图

M1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11

M2

200kD 116kD

97.4kD 66.2kD

97.2kD 66.4kD

43.0kD

44.3kD

31.0kD 29.0kD

20.1kD

20.1kD

14.4kD

14.3kD

6.5kD

M1: Low molecular weight protein marker

低分子量蛋白质标准

M2: Broad-range molecular weight protein marker

宽范围分子量蛋白质标准 1~11: Influenza Virus Vaccines 流感疫苗成品

图1 十一种流感疫苗的非还原SDS-PAGE Fig.1 Non-reduced SDS-PAGE for 11 Influenza Virus Vaccines