荧光定量RT-PCR步骤

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荧光定量RT-PCR步骤

荧光定量real-time PCR反应步骤

一、RNA的抽提（捷瑞试剂盒GK3011）

准备：

1. 95%乙醇184ml+ DEPC水至250ml（70%），擦拭台面（量筒、250ml瓶DEPC处理）

2.配置2ml氯仿/异戊醇（960ul﹕40ul）2管，20次

3.配置RPE Solution液，RPE/无水乙醇（180ul﹕720ul）10管，20次

4.恒温加热器调整到65℃

提取：

1.细胞（10）消化离心，转移至1.5mlEppendorf管内，离心，去上清

2.1mlHanks液稀释、吹散，取25ul细胞计数（约10/L）结果乘以0.01即细胞量，其余细胞离心，去上清，加入0.5mlTrizol

3.1ml注射器抽吸，裂解细胞后，加入100ul氯仿/异戊醇，剧烈震荡混匀30sec，12000rpm，5min

4.上清液转移到另一Eppendorf管内加入150ul无水乙醇混匀

5.将全部溶液（包括沉淀）转移到套放于2ml收集管内的GenClean柱内，室温放置2min，12000rpm，1min

6.取出柱子弃去废液，再将柱子放回收集管内加入450ulRPEsolution，12000rpm，30sec，并重复一次

7.取出柱子弃去废液，再将柱子放回收集管内10000rpm，30sec

8.取出柱子，放入Eppendorf管内，柱内膜中心加入40ulDEPC-H2O（包装盒内的），65℃，2min

9.12000rpm，1min，管内即为RNA样品，-70℃保存。 96

*10细胞约可提RNA100ug

*1OD260=40mg RNA，浓度=（OD260-OD320）×稀释倍数×0.04ug/ul

*RNA的分析定量：测定在260和280nm的OD值（TE Buffer稀释），OD260/280=1.8～2.0视为提取的RNA纯度很高，小则蛋白质污染，大则RNA被水解。

*肌肉细胞的trizol使用量应该加大

二、RT反应

1.在microtube管内加入如下反应液（冰上）

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2.65℃ 5min, 冰上急冷（﹥1min）

3.再向管内加入如下反应液（冰上）

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4.逆转录反应

1.30℃10min（用Random 6 mers时，用Olig dT省去此步），2.42℃（到50℃之间）45min，3.70℃15min，4.降温到4℃ 6

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