荧光定量RT-PCR步骤
上传者：黄春雷|上传时间：2015-05-05|密次下载
荧光定量RT-PCR步骤
荧光定量real-time PCR反应步骤
一、RNA的抽提（捷瑞试剂盒GK3011）
准备：
1. 95%乙醇184ml+ DEPC水至250ml（70%），擦拭台面（量筒、250ml瓶DEPC处理）
2.配置2ml氯仿/异戊醇（960ul﹕40ul）2管，20次
3.配置RPE Solution液，RPE/无水乙醇（180ul﹕720ul）10管，20次
4.恒温加热器调整到65℃
提取：
1.细胞（10）消化离心，转移至1.5mlEppendorf管内，离心，去上清
2.1mlHanks液稀释、吹散，取25ul细胞计数（约10/L）结果乘以0.01即细胞量，其余细胞离心，去上清，加入0.5mlTrizol
3.1ml注射器抽吸，裂解细胞后，加入100ul氯仿/异戊醇，剧烈震荡混匀30sec，12000rpm，5min
4.上清液转移到另一Eppendorf管内加入150ul无水乙醇混匀
5.将全部溶液（包括沉淀）转移到套放于2ml收集管内的GenClean柱内，室温放置2min，12000rpm，1min
6.取出柱子弃去废液，再将柱子放回收集管内加入450ulRPEsolution，12000rpm，30sec，并重复一次
7.取出柱子弃去废液，再将柱子放回收集管内10000rpm，30sec
8.取出柱子，放入Eppendorf管内，柱内膜中心加入40ulDEPC-H2O（包装盒内的），65℃，2min
9.12000rpm，1min，管内即为RNA样品，-70℃保存。 96
*10细胞约可提RNA100ug
*1OD260=40mg RNA，浓度=（OD260-OD320）×稀释倍数×0.04ug/ul
*RNA的分析定量：测定在260和280nm的OD值（TE Buffer稀释），OD260/280=1.8～2.0视为提取的RNA纯度很高，小则蛋白质污染，大则RNA被水解。
*肌肉细胞的trizol使用量应该加大
二、RT反应
1.在microtube管内加入如下反应液（冰上）
内容需要下载文档才能查看2.65℃ 5min, 冰上急冷（﹥1min）
3.再向管内加入如下反应液（冰上）
内容需要下载文档才能查看4.逆转录反应
1.30℃10min（用Random 6 mers时，用Olig dT省去此步），2.42℃（到50℃之间）45min，3.70℃15min，4.降温到4℃ 6
下载文档
热门试卷
- 2016年四川省内江市中考化学试卷
- 广西钦州市高新区2017届高三11月月考政治试卷
- 浙江省湖州市2016-2017学年高一上学期期中考试政治试卷
- 浙江省湖州市2016-2017学年高二上学期期中考试政治试卷
- 辽宁省铁岭市协作体2017届高三上学期第三次联考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2016-2017学年高二11月月考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2017届高三11月月考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2016-2017学年高一11月月考政治试卷
- 广西钦州市高新区2016-2017学年高二11月月考政治试卷
- 广西钦州市高新区2016-2017学年高一11月月考政治试卷
- 山东省滨州市三校2017届第一学期阶段测试初三英语试题
- 四川省成都七中2017届高三一诊模拟考试文科综合试卷
- 2017届普通高等学校招生全国统一考试模拟试题（附答案）
- 重庆市永川中学高2017级上期12月月考语文试题
- 江西宜春三中2017届高三第一学期第二次月考文科综合试题
- 内蒙古赤峰二中2017届高三上学期第三次月考英语试题
- 2017年六年级（上）数学期末考试卷
- 2017人教版小学英语三年级上期末笔试题
- 江苏省常州西藏民族中学2016-2017学年九年级思想品德第一学期第二次阶段测试试卷
- 重庆市九龙坡区七校2016－2017学年上期八年级素质测查（二）语文学科试题卷
- 江苏省无锡市钱桥中学2016年12月八年级语文阶段性测试卷
- 江苏省无锡市钱桥中学2016-2017学年七年级英语12月阶段检测试卷
- 山东省邹城市第八中学2016-2017学年八年级12月物理第4章试题（无答案）
- 【人教版】河北省2015-2016学年度九年级上期末语文试题卷（附答案）
- 四川省简阳市阳安中学2016年12月高二月考英语试卷
- 四川省成都龙泉中学高三上学期2016年12月月考试题文科综合能力测试
- 安徽省滁州中学2016—2017学年度第一学期12月月考高三英语试卷
- 山东省武城县第二中学2016.12高一年级上学期第二次月考历史试题（必修一第四、五单元）
- 福建省四地六校联考2016-2017学年上学期第三次月考高三化学试卷
- 甘肃省武威第二十三中学2016—2017学年度八年级第一学期12月月考生物试卷
网友关注
- 描写竞争的好词好句好段
- Chapter 2 Establishing Business RelationsWord
- 六级高频词组
- 脉冲电流作用下电子风应力模型与计算示例
- 产品质量事故管理办法
- 施工企业规范化管理制度(集团级)--聘用外部专业技术人员管理规定
- 东大17春学期《现代远程学习概论 》在线作业满分答案
- 平川区魏家地学校召开“提素质 树形象 做合格教师”学习教育动员大会
- 中国双金属带锯条制造行业投资策略研究及发展建议咨询
- 海南省2016年下半年经济师《中级财政税收专业知识与实务》：转移性支考试试卷答案
- 2014-2017年八角讲坛(创新创业类)汇总
- 陕西省注册会计师考试《会计》：关联方关系的判断考试试卷答案
- 资产配置Word
- 数学报练习答案
- 怀念母亲
- 电影结构分析Word
- 何庄小学幼儿园自查报告
- 高二化学期末复习试题(理科班)答案
- 感受赞美教学设计
- 734条高频词组笔记(四六级必看)
- 科学：动物之最 (2)Word
- 养老保险
- seo实用工具
- 民法总论概述Word
- 记叙文写作中的细节描写 三中 周春梅Word
- 标识课件Word
- 22.牧场之国
- 混凝土测温方案
- 升降国旗制度
- 国培讲座：新媒体与教育Word
网友关注视频
- 【部编】人教版语文七年级下册《泊秦淮》优质课教学视频+PPT课件+教案，湖北省
- 七年级下册外研版英语M8U2reading
- 苏教版二年级下册数学《认识东、南、西、北》
- 【部编】人教版语文七年级下册《过松源晨炊漆公店（其五）》优质课教学视频+PPT课件+教案，辽宁省
- 青岛版教材五年级下册第四单元（走进军营——方向与位置）用数对确定位置（一等奖）
- 每天日常投篮练习第一天森哥打卡上脚 Nike PG 2 如何调整运球跳投手感？
- 北师大版数学四年级下册3.4包装
- 第五单元 民族艺术的瑰宝_16. 形形色色的民族乐器_第一课时(岭南版六年级上册)_T1406126
- 【部编】人教版语文七年级下册《泊秦淮》优质课教学视频+PPT课件+教案，天津市
- 沪教版牛津小学英语（深圳用） 四年级下册 Unit 7
- 第19课 我喜欢的鸟_第一课时(二等奖)(人美杨永善版二年级下册)_T644386
- 冀教版英语四年级下册第二课
- 冀教版小学数学二年级下册第二周第2课时《我们的测量》宝丰街小学庞志荣.mp4
- 【获奖】科粤版初三九年级化学下册第七章7.3浓稀的表示
- 化学九年级下册全册同步 人教版 第25集 生活中常见的盐（二）
- 沪教版牛津小学英语（深圳用） 四年级下册 Unit 4
- 沪教版牛津小学英语（深圳用） 五年级下册 Unit 10
- 19 爱护鸟类_第一课时(二等奖)(桂美版二年级下册)_T502436
- 二年级下册数学第三课 搭一搭⚖⚖
- 苏科版数学八年级下册9.2《中心对称和中心对称图形》
- 第五单元 民族艺术的瑰宝_16. 形形色色的民族乐器_第一课时(岭南版六年级上册)_T3751175
- 外研版英语三起6年级下册（14版）Module3 Unit1
- 二年级下册数学第一课
- 8 随形想象_第一课时(二等奖)(沪教版二年级上册)_T3786594
- 3月2日小学二年级数学下册（数一数）
- 苏科版数学七年级下册7.2《探索平行线的性质》
- 【部编】人教版语文七年级下册《老山界》优质课教学视频+PPT课件+教案，安徽省
- 沪教版牛津小学英语（深圳用）五年级下册 Unit 1
- 冀教版小学数学二年级下册第二单元《有余数除法的整理与复习》
- 苏科版数学 八年级下册 第八章第二节 可能性的大小
精品推荐
- 2016-2017学年高一语文人教版必修一+模块学业水平检测试题（含答案）
- 广西钦州市高新区2017届高三11月月考政治试卷
- 浙江省湖州市2016-2017学年高一上学期期中考试政治试卷
- 浙江省湖州市2016-2017学年高二上学期期中考试政治试卷
- 辽宁省铁岭市协作体2017届高三上学期第三次联考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2016-2017学年高二11月月考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2017届高三11月月考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2016-2017学年高一11月月考政治试卷
- 广西钦州市高新区2016-2017学年高二11月月考政治试卷
- 广西钦州市高新区2016-2017学年高一11月月考政治试卷
分类导航
- 互联网
- 电脑基础知识
- 计算机软件及应用
- 计算机硬件及网络
- 计算机应用/办公自动化
- .NET
- 数据结构与算法
- Java
- SEO
- C/C++资料
- linux/Unix相关
- 手机开发
- UML理论/建模
- 并行计算/云计算
- 嵌入式开发
- windows相关
- 软件工程
- 管理信息系统
- 开发文档
- 图形图像
- 网络与通信
- 网络信息安全
- 电子支付
- Labview
- matlab
- 网络资源
- Python
- Delphi/Perl
- 评测
- Flash/Flex
- CSS/Script
- 计算机原理
- PHP资料
- 数据挖掘与模式识别
- Web服务
- 数据库
- Visual Basic
- 电子商务
- 服务器
- 搜索引擎优化
- 存储
- 架构
- 行业软件
- 人工智能
- 计算机辅助设计
- 多媒体
- 软件测试
- 计算机硬件与维护
- 网站策划/UE
- 网页设计/UI
- 网吧管理