荧光定量RT-PCR步骤
上传者：黄春雷|上传时间：2015-05-05|密次下载
荧光定量RT-PCR步骤
荧光定量real-time PCR反应步骤
一、RNA的抽提（捷瑞试剂盒GK3011）
准备：
1. 95%乙醇184ml+ DEPC水至250ml（70%），擦拭台面（量筒、250ml瓶DEPC处理）
2.配置2ml氯仿/异戊醇（960ul﹕40ul）2管，20次
3.配置RPE Solution液，RPE/无水乙醇（180ul﹕720ul）10管，20次
4.恒温加热器调整到65℃
提取：
1.细胞（10）消化离心，转移至1.5mlEppendorf管内，离心，去上清
2.1mlHanks液稀释、吹散，取25ul细胞计数（约10/L）结果乘以0.01即细胞量，其余细胞离心，去上清，加入0.5mlTrizol
3.1ml注射器抽吸，裂解细胞后，加入100ul氯仿/异戊醇，剧烈震荡混匀30sec，12000rpm，5min
4.上清液转移到另一Eppendorf管内加入150ul无水乙醇混匀
5.将全部溶液（包括沉淀）转移到套放于2ml收集管内的GenClean柱内，室温放置2min，12000rpm，1min
6.取出柱子弃去废液，再将柱子放回收集管内加入450ulRPEsolution，12000rpm，30sec，并重复一次
7.取出柱子弃去废液，再将柱子放回收集管内10000rpm，30sec
8.取出柱子，放入Eppendorf管内，柱内膜中心加入40ulDEPC-H2O（包装盒内的），65℃，2min
9.12000rpm，1min，管内即为RNA样品，-70℃保存。 96
*10细胞约可提RNA100ug
*1OD260=40mg RNA，浓度=（OD260-OD320）×稀释倍数×0.04ug/ul
*RNA的分析定量：测定在260和280nm的OD值（TE Buffer稀释），OD260/280=1.8～2.0视为提取的RNA纯度很高，小则蛋白质污染，大则RNA被水解。
*肌肉细胞的trizol使用量应该加大
二、RT反应
1.在microtube管内加入如下反应液（冰上）
内容需要下载文档才能查看2.65℃ 5min, 冰上急冷（﹥1min）
3.再向管内加入如下反应液（冰上）
内容需要下载文档才能查看4.逆转录反应
1.30℃10min（用Random 6 mers时，用Olig dT省去此步），2.42℃（到50℃之间）45min，3.70℃15min，4.降温到4℃ 6
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