天然抗菌肽的作用机理与分子改造研究进展_张庆华

天然抗菌肽的作用机理与

分子改造研究进展

张庆华，徐彦召，王

中图分类号：Q51

青，赵志雨，尚田田，胡建和

文章编号：0529-6005（2014）10-0053-04

（河南科技学院动物科学学院，河南新乡453003）

文献标志码：A

目前细菌耐药问题的日益严重，如超级细菌

的产生，以及动植物食品的药物残留问题，给人类的健康安全产生重大的威胁。而在过去的几个世纪，新型抗菌药物的研发进展一直进展缓慢。因此人们急需一种抗菌活性高、安全、不易产生耐药性的新型抗菌药物。在寻找抗生素替代药物的过程中，人们逐渐把眼光投向了抗菌肽。

抗菌肽（AntimicrobialPeptides，AMPs）是生物在长期进化过程中保留下来的古老而又有效的天然免疫重要活性分子，参与机体的第一道免疫防线，是机体先天免疫系统的重要组成部分[1]。抗菌肽在自然界中广泛存在细菌、病毒、植物、动物包括人体内。抗菌肽对革兰阳性菌和阴性菌、病毒、癌细胞，包括多重耐药菌及HIV病毒都有抑制作用[2-3]。且有实验表明，抗菌肽用于外伤感染时既可抑制细菌感染又能促进伤口的愈合[4]。由于抗菌肽具有高效抗菌、无残留、不易产生耐药性的优点，是目前国际公认的抗生素最佳替代品。

然而，天然抗菌肽也并非是完美的，大部分的天然抗菌肽抑菌活性并不高，且在发挥抑菌效果的同时，往往对正常的真核细胞也产生毒性，以及溶血作用，这都限制了抗菌肽的发展应用。因此，目前对抗菌肽的研究重点在于，通过对人工设计的一系列不同抗菌肽类似物的研究，探明其抑菌、细胞毒性、溶血活性的机制，从而为获得抑菌活性高，对正常真核细胞低毒甚至无毒性、无溶血性，高效、安全的抗菌肽奠定理论基础。

收稿日期：2013-09-26

基金项目：国家自然科学基金（31372469）

作者简介：张庆华（1988-），男，硕士生，主要从事动物微生物学研究，E-mail：zhangqinghua0235@http://wendang.chazidian.com

通讯作者：胡建和，E-mail：xxjianhe@http://wendang.chazidian.com；徐彦召，E-mail：haoxyz365@http://wendang.chazidian.com

到目前为止发现的抗菌肽已有2000多种。已测定了几百种不同抗菌肽的氨基酸序列，这些抗菌肽在长度、结构、序列上各有明显的不同，抗菌肽大多由20～40个氨基酸残基组成，且其一级结构具有明显的特征，即肽链中间富含脯氨酸（Pro），C端富含Gly、Val和Ala等非极性氨基酸，而N端多含精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）等极性的阳氨基酸[5]。因此他们都表现两个共同的特征：离子肽；活性结构为两亲性。目前对抗菌肽的作用机理还没有统一的认识，但是大多数的理论都认为其作用机制与其阳离子性和疏水性有关。因此，为了获得安全、高效的抗菌肽，目前对抗菌肽的结构功能研究以及分子设计主要是围绕改变其离子性和疏水性进行。1

抗菌肽的结构分类

在Boman发现抗菌肽后，最初根据结构，将抗菌肽分为如下5类：

Cys，目前此类成员最多，天蚕素（Cecropins）、滑瓜

α-螺旋是一种具有水脂两亲性的结构，存在（1）具有α-螺旋结构的线性抗菌肽。不含

蟾素（Magainins）属于此类。

于多种蛋白质的二级结构中，许多膜蛋白、信号肽以及具有膜识别功能的蛋白质中都含有此结构，是抗菌肽裂解细菌膜的重要活性区域。

者，此后人们陆续从家蚕、果蝇、柞蚕、麻蝇中分离

Cecropin是第一个被发现的天然抗菌肽的研究

得到cecropin类抗菌肽，这类多肽一般含有37～39个氨基酸残基，不含Cys，其C端区域可形成疏水性的螺旋结构，N端区域具有较强的碱性，可形成典型的双亲性螺旋结构，两者之间存在由脯氨酸和甘氨酸形成的铰链区。且多数肽的C端被酰胺化，研究表明酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。

Magainins也是最初从蟾蜍的皮肤中分离得到

中国兽医杂志2014年（第50卷）第10期ChineseJournalofVeterinaryMedicine

的一种具有双亲螺旋结构的抗菌肽，后来在哺乳动物的神经组织和肠道组织中发现了其类似物。Magainins对革兰阳性菌、阴性菌、真菌、原生动物都有杀伤作用，但是对革兰阴性菌的活性比cecropins要低10倍左右[6]。

（2）富含某种氨基酸（但不含Cys）的抗菌

板”模型和“毯式”模型两种方式。

2.1“桶板”模型“桶板”模型的理论早在1977OrenZ等人据此理论对抗菌肽对细胞膜的作用方

年由Ehrenstein和Leca等人提出[9]。后在1988年式进行解释。由于大多数的抗菌肽带有正电荷，细胞膜带负电荷，静电吸引作用使抗菌肽在细胞

肽。在其结构中有一种或两种氨基酸残基重复出现，如PR-39、Indolicidin和Histantins。

PR-39最先在1991年由Agerberth等人在猪

膜表面发生聚合，单分子的抗菌肽形成多聚体，并以垂直细胞膜表面的形式将其疏水基团嵌入细胞膜的磷脂双分子层内，形成横跨细胞膜的离子通道，其他的多聚体在通道周围连续的插入，不断扩大通道的范围，在细胞膜表面形成大的孔洞结构，细胞膜的完整性遭到破坏，细胞膜内外可自由发生物质交换，最终使膜发生崩解。虽然该理论确认了抗菌肽的阳离子性和两亲性结构在作用机制中的重要作用。现在研究表明，抗菌肽的二级结构为圆柱形的α-螺旋分子结构，在圆柱形纵轴的一端为带正电荷亲水基，对称端为疏“桶板”理论中抗菌肽在嵌入细胞水基[10]。但是在

膜中是以垂直细胞膜的形式将疏水基插入磷脂层内部，而不是带正电荷的亲水一段最先嵌入磷脂层，明显和抗菌肽与细胞膜结合的静电吸引动力学不相符，因此仅是疏水基在形成垂直孔道前，其在膜表面的“锚定”机制还有待深入研究。2.2“毯式”模型

1992年PounyY提出“毯式”模

的小肠中分离纯化得到，对其序列分析显示，PR-

（Proline-arginine-rich），其一级结构中富含精氨酸（Arg）和脯氨酸（Pro）两种氨基酸残基，其中Arg10

39由39个氨基酸残基组成，故将其命名为PR-39

个、Pro19个，在其结构中，精氨酸和脯氨酸形成的Pro-Arg-Pro结构可能与细菌的磷脂膜的相互作用有关[7]。

（3）含1个二硫键的抗菌肽。该二硫键的位置通常在肽链C端。目前此类成员最少，最先被发现的是在牛嗜中性粒细胞中分离得到的Bacte?并在其第2位和第11位氨基酸残基间形成二硫necin，其由12个氨基酸组成，其中精氨酸有4个，键，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌都有抑制活性。这类抗菌肽还包括蛙Brevinins-1、-2等，都研究的较清楚。

β-片层结构。如防御素（Defensins）如爪蟾皮肤细胞中产生的Brevinins。有两个或两个以上二硫键，具有β-折叠结构的抗菌肽。如绿蝇防御素子内二硫键，肽链C末段是带有拟β-转角的反向平行的β片层。

（5）来源于具有其他功能的大分子蛋白的抗菌肽，如羊毛硫抗生素（Lactoferricins）是一类由细菌基因编码，在核糖体中合成，经翻译加工后而含有一些特殊有机基团的多肽抗生素。如乳链菌肽（Nisin），产自乳酸杆菌，含有羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸等特殊基因，由34个氨基酸残基组成，只对革兰阳性菌有作用。2

抗菌肽作用机理研究进展

虽然目前对抗菌肽的生物活性作用机制还没有统一的理论体系，但大多数人认为抗菌肽主要通过作用于细胞膜而发挥其生物活性作用[8]。关于抗菌肽与细胞膜作用机制，比较认同的有“桶(Phomlindefensin)，其分子内有6个Cys形成3个分

（4）含2个或2个以上二疏键的抗菌肽，多为

“桶板”模型相比，在该学说中，抗菌型理论[11]。与

肽同样通过电荷吸引作用结合于细胞膜表面。并不进入细胞膜内部，大量抗菌肽被吸引但是，

结合至细胞膜表面后，像地毯一样平行排列于细胞膜表面，当抗菌肽的浓度达到一个临界浓度时，在分子张力和疏水作用下，细胞膜的表面张力发生改变，抗菌肽所覆盖范围的细胞膜稳定性下降，形成不稳定的磷脂膜，细胞膜表面出现明显的皱褶弯曲甚至破裂，可使细胞膜内外发生物质相互渗透，改变细胞膜内外的正常渗透压，抗菌肽分子也可进入细胞内部。目前已有学者通过对抗菌肽进行固态核磁共振实验，研究结果支持该学说。王兴顺等采用偏光衰减全反射傅立叶变换红外光谱技术（ATR-FTIR技术）对在蛾血pinP1与细胞膜结合后紧贴在细胞膜表面而不进性下降，并破坏膜的完整性[13]。2.3

抗菌肽作用机制研究进展

淋巴中提取的CecropinP1进行研究发现，Cecro?

入疏水环境，CecropinP1覆盖区域的细胞膜稳定

He、LazaridisT等

人采用基于粗粒化模型的模拟方法建立了53种具

有α-螺旋结构的天然抗菌肽的隐式膜模型[13]。通过对收集到关于抗菌肽分子在磷脂双分子层聚集的模拟过程中结合能与自由能等热动力学数据，以及表面电荷变化的数据，分析发现，决定抗菌肽的生物活性的两个重要因素：抗菌肽与膜的亲和力以及所结合生物膜所能承受的临界表面覆盖率（可能在50%～90%）。相比于计算机全原子模拟，隐式膜的模拟方法可在更长时间尺度和更大空间尺度上提供模拟体系的自由能、温度、压力等关于蛋白质分子在脂质双分子层上聚集过程的分子动力学和热力学数据[14]。真核细胞膜和细菌膜表面所带电荷含量的不同影响了抗菌肽对他们选择的特异性，因为模拟抗菌肽的抑菌过程中，能量转移多发生在阴离子脂质含量超过30%的膜与抗菌肽之间。而在模拟溶血过程中，能量转移多发生在阴离子脂质含量在10%左右的生物膜与抗菌肽之间。而且抗菌肽自身的表面结合率是指示其抑菌活性的一个重要指标，疏水基嵌入生物膜的深度是影响溶血活性的重要因素，而其抗菌活性和溶血活性都受其自身结构稳定性的影响。

Lopez-Oyama等通过对二棕榈酰磷脂酰胆碱

都认为其生物活性与其自身的阳离子性和两亲性有密切的关系。抗菌肽的阳离子性决定了其选择性，能让其与带负电荷的微生物细胞膜发生静电吸引而相互作用，疏水性的氨基酸残基则保证了抗菌肽能有效的渗透或嵌入细菌细胞膜的脂质双分子层内部，形成疏水通道，破坏膜的完整性，进而导致细胞膜裂解。因此，目前对抗菌肽进行分子改造，进行分子设计策略可概括为以下两方面：

（1）以天然抗菌肽构效关系为依据，通过C末端酰胺化、对其一个或者多个位置上的氨基酸残基定点突变、改变肽链长度以及将结合不同的肽链优点形成杂合肽等方式，设计一系列的抗菌肽类似物，筛选出具有更高活性、安全的抗菌肽。

（2）对比已测定具有α-螺旋结构的天然抗菌肽氨基酸序列，通过序列修饰改变其α-螺旋结构域及其带的正电荷量、肽链长度，增强肽链的两亲性质，设计新的序列模型，进而筛选出抗菌谱更广、抑菌活性更高的抗菌肽。

ConcettaAvitabile等人从欧洲林蛙中分离得

到Temporin-B（TB），分析发现TB由13个氨基酸组成，一级结构为LLPIVGNLLKSLL，实验发现TB对革兰阳性菌具有一定的抑制效果，由于脂多糖

（DPPC）脂双层及十四酰磷脂酸（DMPG）与阳离型的形成机制，在电镜下观察发现肽吸附在DP?于地毯形状的长丝状网格[15]。

子抗菌肽Bactenecin间的相互作用探索“毯式”模PC上的过程，显示DMPG聚集组装肽，形成类似

Anne等在对枯草芽孢杆菌中一种阳离子多

分子（LPS）间的自缔合作用，TB不易穿透细菌膜壁，而对阴性菌抑制效果较差。通过对TB进行丙氨酸扫描定点突变处理，用丙氨酸代替其一级结构序列中的一到两个氨基酸残基，得到16种TB类似物，通过抑菌试验、细胞毒性及溶血性试验。发现TB-G6A（即用疏水性更强的丙氨酸-A替换TB一级结构中第6位的甘氨酸-G得到的类似物）抑制革兰阳性菌的能力明显增强，而TB-P3A、TB-N7A、TB-S11A表现出与TBMIC接近的抑菌水平，其他的TB类似物则都完全失去了抑菌能力。在TB-G6AN端起始部位连续添加两个赖氨酸（K)，延长了肽链长度，并增加了肽链的正电荷量至+4，得到一级结构为KKLLPIVANLLKSLL的类似物TB-KKG6A，与TB-G6A相比TB-KKG6A对革兰阳性菌及阴性菌的抑菌活性有明显的提对革兰阴性菌的抑制效果也有一定程度的增升，

且不表现溶血活性[19]。强，

Yanga等通过对富含精氨酸和脯氨酸的抗菌

肽（TatA）进行研究时发现，由于自身带正电荷的特性，TatA通过电荷的吸引作用和相邻的蛋白质在连接点进行折叠，形成类似于拉链“咬合牙齿”的结构，在抗菌肽作用于细菌生物膜的过程中，这种电荷”拉链原则”，可以将电荷拉链浸入疏水的磷脂双分子膜从而产生一种压力效应，抑制细菌生物膜的产生[16]。

MeiHong等通过核磁共振分析猪源抗菌肽

Protegrin-1（PG-1）的在细胞脂质双层中的研究发现，PG-1通过自耦连作用以多聚体的形式插入脂质层内部，形成跨膜通道，且革兰阴性菌细胞膜上脂多糖（LPS）的强负电荷特性，在抗菌肽对细胞生物膜的选择过程中起重要作用[17-18]。3

抗菌肽分子设计的研究策略

在目前，对抗菌肽的抗菌机理，细胞毒性、溶血活性等机制虽尚无统一理论，但是大多数理论

肽Tritrpticin进行研究，用赖氨酸替换Tritrpticin氨基酸序列中的精氨酸，虽然二者的空间结构没有发生明显的改变，但改变后的抗菌肽抑菌活性增

中国兽医杂志2014年（第50卷）第10期ChineseJournalofVeterinaryMedicine

加了2倍且溶血性大大降低。天然的Tritrpticin具有极强的结合两性离子和阴离子的能力，而替换后的Tritrpticin仅与阴离子有极强的结合能力，而与两性离子的结合能力降低[20]。

蝎子的抗菌肽IsCT，该抗菌肽没有细胞选择性，对哺乳动物和细菌细胞都有溶解活性。为了探索IsCT的结构与功能的关系，Lee等设计一种新型具有细菌特异选择性的抗菌肽，并合成了几个IsCT的类似物，2D-NMR核磁共振分光术分析溶液中类似物的三维结构。类似物[K7]-IsCT，从第2位的Leu到第13位的Phe是一个线性α-螺旋；类似物[K7，P8，K11]-IsCT中间有一个弯折，且其标下暗处最强的抗菌活性而无溶血活性，说明脯氨酸引起的弯折对IsCT的选择性有重要作用。色氨酸荧光显示[K7，P8，K11]-IsCT的细菌高选择性和其对富含阴离子磷脂类的高度选择性有密切关系。4

前景展望

2011年，印度新德里NDM-1超级细菌的发

[21]

酸、正电荷量、疏水性、亲水性等方面进行了阐述，并对目前人们较为认可的两种抗菌肽作用机制：“毯式”模型及“桶板”模型的最新研究进展总结，力求为人工合成抗菌肽的分子设计奠定理论基础。参考文献：

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mechanismsofpeptideanalogderivedfromcell-penetratingpep?[J].Appliedmicrobiologyandbiotechnology，2013，97（4）:1711-

物活性机制的认识还处于模糊和分散的状态。因此对抗菌肽的研究重点在于通过对其抑菌作用进行综合、广泛的研究，通过明确的生物活性机制理论，推动抗菌肽产品的开发与临床应用。

自第一个抗菌肽Cecropin发现30多年以来，由于其生物活性机制独特，又在自然界广泛分布，一直是人们研究的热点。在“肽时代”真正到来之前，我们需要解决的问题还有以下几个方面：（1）来源问题：天然抗菌肽资源有限，分离提取工艺复杂，通过化学方法合成的成本高昂；（2）抗原性问题：与化学药物分子相比，抗菌肽的分子量要大得多，故其抗原性也可能比较强，抗菌肽是否会成为一种强致敏原还尚未可知；（3）因为抗菌肽属于一种活性蛋白质，做为口服用药，如何避免消化道酶的消化作用还有待研究。

目前，对已发现抗菌肽的结构特征及生物学活性研究已经比较彻底，但其作用的机制及其与结构之间存在的具体关系，目前还不是很清楚。本文通过对影响抗菌肽活性的重要因素，如氨基酸一级结构、肽链的长度、α-螺旋结构、特殊氨基

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质粒介导的喹诺酮类药物耐药机制研究进展

夏利宁，南海辰，底丽娜

（新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐830052）

中图分类号：S859.7

文献标志码：B

文章编号：0529-6005（2014）10-0057-02

肠杆菌科细菌对喹诺酮类药物耐药性日益加重，以往喹诺酮类的耐药研究多集中在染色体介导的

靶位改变、膜通透性降低、外排泵亢进机制，质粒介导的喹诺酮类耐药鲜见报道。近年来出现一种质粒介导的喹诺酮耐药（plasmid-mediated-quinolone-resistance，PMQR）因子，是一种新的喹诺酮耐药机制。到目前为止发现3大类（qnr，aac（6′）-Ib-cr和qepA或oqxAB）由质粒介导的喹诺酮耐药类型。这些由质粒介导的耐药基因可以在菌间进行水平传播，使其他细菌获得新的遗传物质而主动产生耐药性，加大细菌耐药性传播的风险。本文就新出现的喹诺酮耐药机制综述如下。1

和拓扑异构酶的喹诺酮耐药决定区（Quinolones

resistancedeterminingregion，QRDR）的位点突变，使得含有qnr的菌株更加容易对喹诺酮药物产生更严重的耐药[1]。而且qnr基因常与其他多种耐药基因共同整合，限制了临床治疗相关细菌感染时选药或联合用药的范围。

qnr基因的新进展随着新的qnr基因的发现，世界各地学者在人、动物及环境中发现不同的基因亚型种类，目前已知的qnrS有4个亚型，qnrB有23个亚型，qnrA有6个亚型[2]，2010年，周明明等人在海藻希瓦菌中发现一种新的qnrA7基因亚型[3]，2013年邵宜波等发现了qnrB24新亚型[4]，2013年杨晓燕等人Adachi等人首次在水生环境中检测出qnrS1[6]，2012们的重视，可能以后将有更多的亚型被发现。2

首次从铜绿假单胞菌中发现qnrA1基因[5]，2013年

qnr介导的喹诺酮耐药机制

1998年在美国阿拉巴马州伯明翰医学研究中

心，Martínez-Martínez等首次报道从一株肺炎克雷伯氏菌中获得一个可转移喹诺酮类耐药性的质粒pMG252，他们将质粒携带的引起对喹诺酮类药物耐药的基因命名为qnr（Quinoloneresistance，后来被命名为qnrA）。研究发现qnr基因可在不同细菌中迅速水平传播，它的存在还能加速细菌的染色体促旋酶

收稿日期：2013-10-21

基金项目：国家自然科学基金项目（31260614）；新疆维吾尔自治区普通高校重点学科（基础兽医学）科研启动基金

作者简介：夏利宁（1975-），女，副教授，博士，研究方向为兽医药理与毒理学，E-mail：xln750530@http://wendang.chazidian.com

年Mokracka等人在欧洲首次检测出qnrD[7]，随着人

aac（6′）-Ib-cr的首次发现及其作用机制

2006年，哈佛医学院的Hooper等在研究qnrA介

导的喹诺酮类耐药性时发现有些含qnrA的接合子对环丙沙星的MIC值为1mg/L，较其他结合子高4倍，进一步通过基因敲除试验，证实这种较高水平的耐药性是由与qnrA位于同一质粒上的氨基糖苷乙酰转移酶的变异基因aac（6′）-Ib-cr编码的灭活酶引起的。aac（6′）-Ib基因属于aac（aminoglycosideacetyltransferase，编码乙酰转移酶）基因，能使细菌对

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