第九章 基因工程和基因组学Word

　　第十二 基章因程工基因和学

　　组 一节

　　第因工程 基 二节第基因组 学

　　第一节 基因工程遗工传程基或因程，工是将子分遗 学的传论与理程工术相技合结，用来改造、 建动物创和物新品植，种业化生 工产物生产品诊断，和治人疗遗传类病疾 一的个新领域。 本章将重点 介绍遗传程的工基原本 理方法，和以及一应些实用例。

　　第节 一因工基程遗传工程一可分般为 : 狭义传工程：指基遗工因程(重D组N技A)。术 广义遗传 程工包：蛋括质白程、细胞工程、工染 体工色、细胞程器程、工基因工及酶程工 程。等

　　、基一因程概述1工 基因工.的概程念 基因 程工：在分水平上，采子取程建工 方式设→按预照设计的蓝先→借助图 实于室验技→术某种生物将基的因或基因 组转移另到一生中去→使物者后定获向得 新传性遗的状一技术。门 基 工程因术技的建立，实验生物使学 域产生巨大变革。领

　　因工程基

　　因基工程g(eetnic eginneeirgn又称)因拼基接技术 DN和A重组技，是术以分子遗学为传论理基础 以，子生物学分和微物学生的代方现为法手 ，段将不来同的源基按因先设计预的图，蓝在体 外建构杂DN种分子A然，后入导活胞细 以，变生改原有物的遗特传、性获新得品、种生产新 产。品 因工基技术为程基的结因构和能的研功提究供 了力有的手段。

　　基因工程g(neeitc egineneing)r

　　所基因谓程(工egenti cneignerengi)是在子分平水上对 因进基操作的行杂复术，是技外将源因基过通外重体组后导入受体细 胞内使，个这因能在基体细胞内复 受、制转、录译翻达的表作操。 是它人用为的法方所将要的某需一体生供物遗传的 物质—D—A大N子提分出取来，在离体条下件适用的当工 具酶进切割后，行它与作把为体载D的AN子分接 连来起然后，与体一起载入导某一易生长、更殖繁的 受体细中胞以让，源物外在质其“安家中落户”,行进 正常复制的表和，从而获得新达种物的种崭新一术技。

　　基工程因有个两要重的特第征：可把一自任何来物生基的转因移 与其到毫无关系的任其何他体受细中胞 因，可以此现按实照们人的愿，望改造生物的遗 传特，创性出生物的造性状新； 第：某一二段NA可D在受细体内进胞 行制复，准备大量纯为的DN化片A段供 了提可能，宽了分拓生物子的研学究域。领

　　基因工 的程展发

　　196年9世全转界因基植物植面种积为71万0顷公 ，197年为19100万公顷 1,9982年708万顷公，1 99年3990万公顷9 2,000442年万公0顷，2 01年52600万公顷 2,002年0500万公顷。

　　. 基因2工程发展的

　　2001种植年积面100公万的转基顷作因：物 大(豆330万3hm,占2世全界转基作物因的 63,均%为除抗剂草豆大、玉)米9(08万m2 h, 1占%9 、棉花()86万h02 ,占m13%)、 油菜 220 7m h 万( 占，5% ) ;其它还水稻有小、、花生、麦日葵亚、、甘麻蓝、 马铃薯等，茄番、草烟南、瓜和瓜木50等种转基 多作物因已培育成功 主要。分布美在(国5703万mh2)阿根、廷1(108万 m2h、)拿大(3加20万m2h)中国(1和0万5m2h) 国。等

　　2010全世界转基年因物作相应作物 种占总植积的面比

　　. 因基工程内容的

　　①细从胞和织中组分离NAD; ②限制内性酶酶切切NA分子D,制备DAN片段 ③; 将切D酶N分子A与载D体NA接连→ 构 建在能宿主细 内胞自复我制重组的DN分子A; 把④重DNA分组子引宿入受体主胞细→复制 ； ⑤重组NA随宿主D胞的分裂而分配细子细胞到 建→立性无繁系(clo殖n)或e育发成体个 ； 从细⑥群胞中体选出所要需无性繁殖的→并使 外源基因在系受细体中正胞常表达，翻译成白蛋 质基因产物、回收等；或选筛出获得定性向变异状 个体的

　　。

　　.4因基工的操作程步骤1.取获目的因基实施基是因程的工第步一。 如植的抗物(病抗毒、 病细菌抗基因，种) 的贮子藏白基蛋因，以人及胰的岛素因，干基扰 基因素，都等是目的基。 要从因瀚的“基浩因海”中获得特定的目的洋 因，基十分是易的。不科学家经们不懈地探过索 ，想了出多许办法，中主其有要两条径途 ： ⑴ 从体细胞的供DNA中接直分离基因； 人⑵合成工基。因

　　人工成基合因的方

　　法 前人目工成合基因方法的主有要两条 。条一径：以途目的基转因录成信的使RNA为模 ，版反录成转互补单链D的NA然后在酶的作，用下 成双链DNA,从合获而所得需要基的。因另 条一途径根：已据的蛋知白的氨质基序列酸 ，推测出应相信的使RA序N,列然按照碱基互 补后对配原的，则推测出它的因的基核酸苷序， 再列通化过方学，法以单苷酸核为料原合目的基成因 。人如血的红白基蛋、胰因岛素基因就等以可通 人工合过成因基的法获方得。

　　获

　　得目基的的因径目途基的：因准指导备受入体胞细内，的 以究研或用为应目的所要需外源的因 基目的基因。 称 获 目得基因的的法很多，方也但十是分困 的难一。步 前获得目目的因基有4条径：

　　途1.

　　.P3CR应反合D成AN合酶链式反聚应(CRP)以是NAD变性、 复的某些特性为原理设制的。计 通 过CR技术P取获需要所的异DNA特 段片实在际应得非用多常，但前提条是件 必是对须的基目因一有定的解，需要 设计了引。 物PR技术的C理原下：如

　　聚酶合链反应(PCR式的)骤(3步反)应系中还有高体 D温N A

　　聚合，以酶及 作原为料材的种四脱核氧三磷苷(酸4 dXNTP) 。 高 DN温A聚合 酶自一来特殊的耐高温种菌， 俗细称 Taq 。酶 在 7℃0 高温，经下 Tq a催化酶，四以种脱 核苷三磷氧酸原为料，形成在互补引的物寡核 苷酸，后迅合成一速与条模 D板AN单 (链 链或负链)正补结合互D的AN新链

　　。聚合酶链

　　。.mR4N差异A显示获法目得基的 因

　　mRNA差异示(显RmNAdi fefenrtal dispilay D,D)1是929由哈佛年学医院PengL iag等n人 立的建 。理：原先P用RC技术扩增所的mR有A、N成生c NA群D,再体用测凝胶电序获泳取所需的要 目的基，然因再后次PCR用扩增 简单。讲，就是的基从因的转产录mRNA来反物转录 c成DA作N目的为基因。

　　5用、机的方法械 如例超波声基把组因打片成。段

　　基因工的操作程步2.骤基表达因载的体建(构即目基的与运因体结载合是实)施 因基工程的第二步也，是因工程基的核心。 将目的 基与运因载体结的合过程实，上际不同是源 来DNA重的组新合的程过。 如果以 质粒为运载作，体先要用一首定的制限切酶 质粒割，使粒出现质个一口缺露，黏出性末。端后用然 一同限制酶种切断的目基因，使产其生相同的性末黏端。 将下的目切基因的的段片入质粒插的切处，再 口加入适D量A连N酶接，粒的质性末黏与端的基目因DN 片A段的黏性端就末因会碱基互补配而结合对， 形一成重组DN个A分子。 如人 的岛素胰因就基是过通种方法与这大肠杆菌的中 质DN粒A子分结，合成重组D形N分子A(叫也组重 质粒的。)

　　因基程的操作步骤工3将.的基目导入因体细受是实施胞因基工的程第步。 三重将组ND分子引A入受体细胞中行扩增。进 基 工程因常用中的受体胞细大有肠杆，菌枯杆菌， 草土农壤杆菌酵，菌母动植和细物等胞。 用人工方法体使重组的D外NA分转移子受到体胞细， 主是借要鉴细或病菌毒侵染胞的细途。径例 ，如果如载运是质体，粒体细胞是细菌，受一是 般细将菌用化钙处氯，以理增大细细菌壁的胞通透，性 含使目有的基因重的质粒组入进受细体胞目的基因 。导入体细胞受，就后以随可受着细胞体的繁而复制，殖 由细于菌繁的殖度速非快常，在很的短间时内

　　就能 获得大量的目够基因的。基因工程的操作步

　　骤.目4基的导入受体因胞细，是否后可稳定以维持和表达其 传遗性特，有通过检测只鉴与定才能知道。这基因工程是的 第四工步作 。 上以步骤成后，在完全的部体细胞受，真中能够正摄 重入DN组A分的子受体胞是细很的少。此，必因须通一过 的手定段受体细胞中是否导入了目对的基进因行测。检 测检方的法有很多，例如，大肠种菌杆某种质的具粒有 霉青素抗基因性当，种这粒与质源D外N组合A在一起成重形 质粒组并，被转受体细胞入后就可，以根受据细胞是否 具有体霉青抗性素判断来体细受是否胞获得目了的基因。 重 D组N分子进A入体受细胞，后受体胞必细须现表出特定的 状，性能才明说目的基因成了表达完过程。

　　、二限性制内切核酶酸1. 限制性切酶(r内etrsction eiznyme:) 种一水D解A的磷N酸二脂，遗传工程中酶要工 具重。 细 菌胞中细在限制修存系统：饰 制限：降外源解DNA,限以制阻或病止侵毒 。这染是细菌细防胞御源异遗信息传入进一的手种段 。修饰 ：饰外修DNA片段后，源保留在细新胞 。中 限*制性切内如酶E:cR o、HInidIII等 酶切 式方：交错以式切断D方A双链，N生二个 产同单链粘性相末。

　　端

　　⑴ 限制内切酶的性命名

　　根 据其来自的生物名称用，文英母和字数字 表；示 ①EoR Ic 来大肠自菌 (E杆cserhciha colii) ;②H nd iⅢ来自血嗜菌 (杆Hemaohplui isnlfeunaze。

　　)⑵

　　限制内性酶的切别类

　　Ⅰ类酶第 ：切割部无特异性，随位机切。割 如cEo(B大杆菌肠B株)E、oKc大肠(杆K菌株 )子量分大(约较000300)作用，时AT需PMg++、等 辅因子。助第 类酶Ⅱ 切：割位有特部性异，识别一能段特异的D N序列A准，地酶确双切链DN的特A异列。 如序EoR I(c肠大杆)菌H、nd Ⅲ(嗜i血菌杆，)分子量 较小( 200约00-01000),0用作时需Mg +存在。

　　+Ⅱ第类特点酶*切 割生平产齐端末(bult nedsn, 如S)amI: * 有的产生粘末端性(sticy keds)n ,B如amHI、 Pst I : * 别特识碱基定序，如顺文回对序称 (palin列domr,又e反称向重复列序 从，个方两阅向其序读相列的同列序) 。

　　部

　　分 常用的 限 制 内 性 酶切

　　、载体(ve三cotr运载)具工：将目的”“基导因入受细胞体 的工具 。 NA片D段+合的载适D体A→重N组在 体载NA的运载下，高D DA→ N效地率入宿主进胞，并在细中进行其制复。 D AN载体：质粒、噬菌体、毒病细菌、 或酵菌母工人色染体等

　　。载

　　的体条件： 具①复有原制，能点我自复； 制②具多 隆位克(mul点itlpe clnonigs ie,tCMS 或opyll nkeirre igno,即)有多种限 酶的制点切； ③ 选 择时的遗传记，标抗如生基素因 ； ④易 从主细宿中回收胞。

　　㈠

　　菌细粒 质 质粒是细菌细内胞立于独菌细染体色自然存而在的、能 我自制复易分离、导入的环状和链 D双AN子分。质粒 有重具表型组测检标记检，是否携带测 源D外A片N。 段在胞细内的制程度： 严紧型：一个细复菌细内胞质粒数有量-2个； 松1驰：每个细型胞内有02-6个。0

　　UpC1质8具有粒下特点以:

　　① 子分量小，可受接大较源DN外片A段 ②; 贝拷数，多500/细个；胞 ③克位隆点的酶位点多，克隆方便切； ④ 具用有检于重组测质粒选择的记标(α – 互补显色表型)的 。 –α补：互来自细菌D指AN la的c酶ZN的一 段端基酸残基(α氨 –肽)在与，α –肽 缺的失la Z酶c混后合，恢能l复ac酶的Z活的一性基种 内互因补象现。

　　㈡λ噬菌体(和型)基温因组全为长9k4b。 噬菌体 NDA中间2约/3序的为中列间基 簇因，两端D为N左、A右臂 。 中 间因簇可被外源基DNA代替不影而响其 侵染菌的能力细。 能 接1受~53k2的外源DNAb片 段→ 为cD作A或核DNNA克的隆体载。

　　㈣

　　穿梭 体载(hsutlt veecorst指)能在种不两生同中物复制载体的 如既。能原在生核物(E.如clo)中i复，制能又在 真细核(胞酵母)中如制复载体。 穿梭载的具体细菌质有的粒制原复点真核 生、的物自复制序列主A(uot-nmouosy leplicraitn sgqueenecA,RS)以两者及的 选择记性状，标有多克具位隆点。

　　穿

　　载梭穿体梭体在细菌中载用克于隆、增扩克隆 基因在酵母，中用于因基达表析分。 酵母 菌Y的E py(esate ispompalasmi) 系列载体d以及IY、YCppY和p系R载体列均 是穿梭体载。

　　工染色人体(batcriale atrficiai chlrmooomesBAC) ,

　　ABC载体一可般携带大50于bk外的源ND片段。A 因F改子造成AB载体，甚至C可用克隆10于kb0 上以的DA片N。段 特： 带点外源有NA的DAC载B在体胞细是单中贝拷的； 体载分子很量(小74k.b);选择标记：氯霉 素抗基性； 因克隆位多点。

　　㈥

　　母人工酵染体色ye(sat artfiicialc homosro

　　me,AY)C

　　YAC有具自复制主列序、隆位点和可克在细和 酵母菌菌选择中的标基记；因还有具母菌酵染体色一些特 点可接；受100-001k0的外源bDN片A段。 YAC成已为人类基因组计划图和克位基因的重 隆要工；并具进促人类了工染人色(体huanma rifticil achrmooomes,AC)H的究。研 991年完成6酵了菌全基母因组序列测的定(图下)

　　YACp4点特:

　　1.两可在酵母菌个利用的选中择基，URA3因和T P1(色R氨合成基酸因；) 2酵母.菌丝粒着列序(ENC); 3.一个自4主制序列复AR(1)S; 4两个嗜热四.虫膜端重末序复(列TLE → 保)重 持Y组C为A线状构结；5.在两个末 序端中间，列一段有填充列序Hi(s3),使p ACY4在菌细胞中细稳定能增扩 6;Am.p抗及细性质粒复制菌点原 7.一个E;oc I R隆克位，位于酵母点菌 uSptRNA4因基。

　　内母人酵染色工体 在克隆源外DN时，用ABamI和EcoHI 双R酶，得到切二人工染色体个，与 Ec臂oIR切酶外源的ND片A段连接，成构重 的酵母人工染组体色，于转化酵用母菌 。

　　* iT质粒特点：

　　1.具 有个主要功五区域能： ①T DNA-LB与：R间B-TNDA序 列整合植物基因到组 ； 质②转移区(P粒);T③ 瘿碱(冠pino)e代区谢； ④复制点原 ； 毒⑤区性。

　　质粒的i两套体载统系： *i质粒是2T0~5000kb环状的DAN子，分要主有 两套体系统载： 双⑴元载(体inbra yecvotrs): 具有两个粒质①用 于隆外克源基片因段克的隆粒：质在Ecol. 和i农杆菌复制，容中易操作，可在二者间转移并 ，一种是穿梭质；粒② 非病质致：具粒毒有基性，没有T因D-AN 序列 。 两个将粒分质别入农杆导中菌经农杆，介菌，导 克质粒中的隆外源NA转移到D植物染体中色。

　　、四因的基分离与定鉴一而般，言个基一 →因是 编一码 多条链的肽个一DAN段，片括启动包子 、终止及内含子子。 等的基目因：指备准入导受体细胞 内，的研究或应用以为目的需要的所外 基因称目的源因。基

　　何如获目的基得?因㈠从基库中因分离基 因 ㈡ PCR扩 基增 因 ㈢ 工人合基成因

　　㈠

　　从基因中库分离因从基基因中分库离基，首因要构先建因 基。 库1.基因 (库gnee lbiarry ) 基因：库组DN一和cDNA序列A隆克 集的体合。 根克隆据的核酸序、列来，源把因库基 为：分基核因库染、体色、库cDA库N 、粒线库等体

　　② 色染基体因库

　　人基因组类项研究目，利中流用细动胞分 (fl拣ow yctomery)技t将人类染色术分开→构体 单个染色建体因基→库加人速基因类作图组分和 。析 酵菌母：利 改良用脉的冲电泳法(puls方de feldigel el etcro-porhessi ,PFGE),将酵 菌母61根染色体 据依分子量其小分开后大，于用建染构体库色，在 基组因分析中的发挥作。用

　　流动细胞拣分(fow lyctmetor)y技

　　③

　　DcN库 A

　　以mRNA为模板→经 反录酶合转成互DN补 (cDANA →) 建构基因库。 大多数真核绝物mRN生A的3端′有具一段聚A多 端尾序列利用一→多段聚T引物为，与多聚A 互补配→双对D链A分子经N端补齐两 以带→限制性 酶切的人工点接头接→ 连酶切与后体(载常通 是噬体菌)连接→制备 cDA库。N

　　cDN

　　库与A核DNA不库同 :

　　cD AN仅具有库胞细或织内组达基因的表m NR序A列→ 仅 括包因组基的分部因基

　　序列 (显外子分部。) DNcA库对于究研因的表基模式达分离和一某 特定基是非常因有的用 如要分。在某一离胞细组或内高织表达的效某种 因，基可该用胞或细织的组mRA构N建DcA N,则库容易很到得个这基。因例如 动，的红物细中胞有具大血红蛋白，量 用红胞细的RNmA建cD构AN库，中从选球蛋择白 基就因方很便。

　　. 2筛基因选库

　　根据选基因相关待信息确→定筛选法方和件条→从 因库中基选筛、离分因基 多。方法数利用一段核苷酸是列序(DN、ADcN或A寡 聚苷酸核)抗体或探针(作robP),用e射性同 位素放或非射性放同位标素探针记→ 筛基因库。 筛选过程库：将 噬菌体感形染的噬成斑印影在菌硝酸纤维膜 上性变与带有目→的基因的射性放DAN或 cNA探针进行D杂→交 放性射自显→影杂 信号 交(黑点)应对噬的斑菌即阳为克隆性

　　限性酶图制：

　　谱用采类似的方法可将，不D同AN用制 性酶限酶，切据其根产生多型性，即的 制性酶片段限长度多型的性来，分析NDA水平 变的异度程以，RLF作为分子标P 进行记基组图因分谱。

　　析 核⑵酸子分交① Sou杂hetr杂交n分析 ： 英由S国uother n(975)1发明，琼将脂 凝糖胶的上NA条D转移到带龙膜尼→进 行DN上分A杂子分析交方的法。 筛选 基库因到阳性克得→ 将限隆制酶性 切酶与Souhetr杂交结合→ 绘制n制性限 酶图谱

　　。

　　⑵核 分酸杂交③ 子Wetesr 杂交n析：分用于白质的分析。蛋

　　⑶ 核酸列序测定定克隆测的DN后片A核酸段序 。列一 般采S用aneg(19r77发明的双脱 氧核糖)酸核终法止定核测序列。酸 在 Sanegr双氧脱法，可中荧用光记标来 代放射替性记标。

　　⑷ 核

　　序列酸析分

　　定测的核酸列是序否基因、有什为么功能，需 用算计机软或生件学物实验进 一步分。 析 ①源同列的分序 ② 无析任何同性的新序源

　　列①

　　同源 序列分的析

　　*同源 比较： 将待测序列性在核酸和蛋白质个水两上比平较基 因的同源性，间序列发送到将Blats D等A DatNa数据进库行比。较 * 读阅架的分框

　　析： 个O一FR一条是能码编一条多链肽的 DN序列，A有具翻译起信始和终号信止号等。 DNcA序列 分可析内子含。

　　等

　　能㈡PC R增扩因基

　　合酶链式聚反应 (polyemrsa ehainc raetcoinPC,)R以体外可快速扩 D增NA。 美M国ulls(i9861发明 )现代生物(发 展史学的上程碑里。

　　)

　　P

　　CR反应个三步 (一聚循环个) :

　　1. 变性 ：9-49℃5使板D模AN双变成单链链 ；2. 复性5:-700下℃,物引别分与补DNA单 互互链配补对 3;.延 伸：引在的物导和引aq酶作T用，7下2 ℃合下模板DNA的成互补。链P CR应通反有2常5-35循环个，般一扩可 5增b左右的片k段 。该技术衍由出一生新些技术，的R如PA和 DALP等F技。术

　　㈢

　　工人合成基因据已根的知因基氨基或序酸列，化将学 合成核寡酸的苷方法与促酶合成 NDA的 方结合起来 法可快很人地合工基成因 。 如OE-PSRCs(eueqnceo erlvpaepd可 增出完扩ext enisonS,EO)术 整的技因基列。序

　　㈢ 人工

　　1.基因转：生长快鱼耐不良、环、肉境质的转好基因鱼中()国。 .转2基牛：因汁乳中含人生有长激素的转基因(牛根廷)。阿.转3黄瓜青枯抗基病因的甜椒5.黄瓜抗青转病基因的马铃枯薯4.转鱼抗寒因的基茄番6.不会引过起的敏基因大豆转

　　.超7级物：导入贮动蛋藏白因的超基级羊超级和鼠 小8特殊.动：物入导基人因具特殊途用的和猪小 9鼠抗.虫棉苏：云金胞芽菌可杆成合蛋白杀毒棉死铃，把这虫分部因 基入棉花的离体导胞中，再组细织养就培获得抗可虫棉

　　。转

　　基因 方的法 和 技 术

　　㈠ 基 因程工业最工应用基因工程生早人产蛋白质的方的 是在法菌细中达表的胰人素岛198()。 2 方法如 左下图所示 。 现已在 细中生菌1产0多种药品例如表皮， 生因长、人生长激子素因子、干素扰乙、型 肝炎程工苗疫等。 目 ，酵前母菌、物植悬浮胞、细植和动株物 养细胞培成均功应用于地表外达源白蛋。

　　基工因程岛素

　　胰岛胰是素治糖疗病的特效尿，药期长来以能 依靠只猪、从等动物牛的腺胰提中，取010K胰g 腺能只取提-45的胰g岛，其产素量低之价格和 之可高想而。知 将合的胰岛成素因基入大导肠菌杆每 ，0200L培养液能产就生100胰g素岛！大 模规工化生产不但解决了这种比黄业金贵还的药品产量 题，问使还价格降其了30低%5%0!

　　因基 工 生 程产 人 的 胰岛 素

　　应 用 大肠杆 菌 产 生 人类 生长 激 素

　　基工程干因素扰 干扰素疗治毒感染病简直“万能是药灵”!过去 人血从中取，3提0L血才提取1mg!其“0贵”程珍 自不度多用。 说基工因人干扰素程α2-b(达芬安 )我是第国一个 全国产业化因基程人工干扰α素2b-具有，抗病，抑毒 制瘤肿胞增细，调生人节免体疫能的功用，广作泛用 病毒于性疾病疗和多种治瘤肿的治，是当疗前际公国 的认毒性病疾病治的疗首选物药肿瘤生物和疗的主 要药物治

　　。

　　其基它因程工物药

　　人造液、血细胞介白、素肝疫苗乙 等过基通因工实程现工化生业，均为 产除解人的病类苦提，人类高的康水平健 发挥了大的重用。作㈡

　　物基因工植程物植基转因化指是外源基因将转移到 植物细内胞并整、到合物植因基中稳组定遗 传和达的过程表 许。多物基植已经被分因离克隆。 、 农 杆菌转法化基和因转枪化应用法多最 。

　　.1根癌 杆菌农化转技术

　　根 癌农菌杆导介植物的化转术技应最用(早双子 叶物植→单 子植叶)。物 程：将目的过基与因动启(花椰子病毒菜3S5 )终止及组子嵌成DN合A分→子插 入到Ti生衍质粒R 与BBL构内重成组质→粒转 化农菌杆胞细→ 用重利组杆农去感染植菌物胞细 使→粒质分部D NA包括的基因，目合到整植物染色→实体遗 现传化转。利 用草抗磷(g甘lyhposae)tE. c lio中离分隆的克EPSP 成酶基因，合已培育高抗出草剂除基因转 植。物

　　农杆

　　菌化法转

　　2.基 枪转因技化术

　　高以压气体动力为，速发高包裹有重射组 DA的N属金颗→ 粒将的基目因直导 入接植细胞物→整 合染色到体。 上化的转体多以载pUC系质列粒为基 构础→建通常 有细具复制菌原及点抗性选择 标记可、在植中物表的达动子、启终止子及 控调序、列物植抗性选标择 记如除(草、潮剂霉素等性)。抗

　　㈢转因动基物

　　转基动物：因的基目因载+→体 重DN组A →微注射量将法重组ND导入A受合子体胞核 细→遗传 转化。如：利用转基 因羊→大量表达 类的人胰蛋 抗酶。 白

　　可分泌类人生因长子的Ⅸ基因转“羊olPl” y 下。为图《iWlmut,N等tareu385 ,1997》

　　。

　　转因羊“Pol基ly”

　　精 卵 受细 胞 射注法

　　基因转牛(精受卵注射)法

　　转基因 鼠左边小鼠 白转为移有 人类生激素 长基因鼠转 ，右为同边胞 对鼠照

　　人类长激素生转因猪基

　　㈣遗传 病诊疾 断

　　利用重组NDA技进行术遗疾病传断，诊直是接 从D A N即基因水平行诊断 →进 准确高，度 度快速。如 进行产诊前断分析，胎是儿有否遗传疾病。

　　性

　　镰②刀贫性病的血断该病诊由-→球白蛋基因一核个酸苷变 (突由GA变G成GG)T致的，这个导核苷 酸改也正好导变致个限制性一酶位切点 改变。 杂 体经合切产生酶型带异，识差别位该点 。

　　2.位基等因特寡异苷核酸法

　　(alelle-pecsfiic logoincleuoidte,SOA)当已知变基突的核因酸苷序时列，可人用工合成 的寡苷酸进行PCR反应核，将PCR 物产作用杂点分析交，定鉴因基型。 种用于这检单个核测酸苷异的变方法称 为AS,O。 法 许遗传疾多可病该用诊断。

　　法

　　2.位等因基异寡特苷核酸法

　　(alelle-pecifsciol ignuocleoitd,eAS)O从血液胞中提细取D NA别分正用常突及变 ASO进的行CP,R杂交 后两的结种果 。A用正常基因(:β A)的ASO进行P C时，R三种基因的信号 强度。 B用：变突因基( Sβ 的ASO)行PC进时R,三 种基的因信强号。

　　度

　　基因㈤疗治

　　如例，漠洛尼用鼠白氏病血病(ML毒V改造)而 的成减病毒毒载体，用于治疗已严重综合免 疫陷缺(CISD。 S)CID是于腺苷脱由酶基因(a氨deosnie ndemanasi,eDA)A突引起，患者无变何免 疫功任。 2能000法国年isFchr用e方法该愈患有SC治DI 遗病的两个婴儿传8个(和11月月个 被)认 是为02纪人世基因类疗上的重大突破治。

　　㈤基因 疗 治方：将法DAA因基入到导MVLr ero vitur 载s→ 取体代该病毒DA中的三个N 因基结构(ag、pgol、nve)→ 重将后 的组病去毒染T细感，使A胞AD基整因合 到细T胞染色体的中→实现基 治疗的因目 的。

　　DNA

　　芯技片术：

　　拟南芥4种c8DA经NCP扩R,增微点样制 成6孔cD9NA芯片野生→型和AT4H突 变mR型N探A针别用分荧素和光丝 丽胺标，将两记针探以:1比例混合并杂交1 同于一芯→ 片别用该两种荧光分激素发波 进行长描得到扫、D图C 桔。色红越，深因表基丰度越达高。E 、F也图同相。

　　D

　　AN芯技术：片

　　DNA芯片的片基玻：、硅璃或片龙等尼。 DNA片芯几从千个点微用同(素位标记) 发→出展610点万的阵芯(片光荧标素)。记应用领 域 ：因基多性态检(测如单核苷多酸态筛选性 ，insgelnu lectodieolpmorpyhissmSNP,)s 基因；达分析表不(同细和不胞组织的同NRA群 比体); 克隆较择选文及库筛选如cD(N文A)库； 基因突检变及遗测病和肿传瘤诊断等的。

　　第二节 基因组学

　　因基组学(egnomcsi ):遗 学传究研进入分水子平后发展起来一个分的支 主，要研究物生内基因体的组子特征。 * 研分究对象 以：整基因组为研究个单位，而不以个基因为单 单作位为究研象对 。 研究*标： 目认识因基的结组构、功能和化；进阐明 整基因组所个含的遗包信息和相传关系；互 分利用有充效资，源预和防治人疗疾类病

　　材料：籼“931稻”。1完 单成位：大华因基研究中心中、院遗传科与育 生发学研物究所12个单等，位00127年启动。 水月平：稻水因组基的总因数约为基46022-56515个 (近人类接基因数两倍)的，工框架图序作已列 盖水覆整稻基个因9组%以上的基因2 方法：。“鸟射击枪法，利用国”产光2000、曙光曙 030超0级算机计1(00亿0次秒/)随对机DN碎A进 行片排序组和装确，其在定基因组正确位的置 计。划功能：基因分析蛋和白质研究 20。2012月21年《日aturN》e布中宣独立绘制国成完粳稻 因基组四第号染色体精确测图序，国对我际国水 稻基因组测计划贡序率献为10。%

　　材料粳：稻日“本”。晴 成完位单中：科国院家因基究中心研4家单等位 水平。第四：号色染体中总的碱基数目0.为35碱亿 对基，盖了覆染该体色全序列9长%8区域，的只下剩7个 小洞，碱空序基列精的度达到确9999.%。完整测定 着丝的序粒列在高生物等中于首属。 计划次：对预鉴定的测6584个因基进作一步析分并 ，着对粒丝功能等作究研 。国际水稻因基组测序计划 国：际水稻粳稻)(基因组划计于始998年，1 本、日国美中国、、法等国国和地家区加。 染色体参:463Mb(9占-01)。%

　　一基因组图谱、构的建

　　因基中核组酸顺序的苷定方法： 利测用有现DN测A序法，方每个测序应反通 只能得常到 800个苷核酸的列。序 ∴小基组物种因常用鸟枪射击法 大基因组。序测存两在问个题 ：*片段数(n) 大，庞段间连片和接配非装复常 杂，重叠数为n2–22;n* 基因 组相同或相似的重中序列在连接和复装配时容 出易。错 决方法解：规模大序测定列前构建基，组图因 可作为谱序列测定制定测序方中的案依，以便锚 定据知的核酸序测在列色染上体位置的

　　测。序方：法*克 隆续序连列法cl(one oncig)t :将因组DN基A割切长成为0.度11M-b的 片段 克大到YAC隆BA或载体上C分 测定单个别隆克序列的 装再配连接连成续的D N分子。 * 定向A枪鸟射法击d(ricete dhstguno:) 以基组因图谱标记为中据依测 序装配 和建不构DN同片A段的列序。

　　遗传㈠谱的图构建

　　1.图 谱记：可用标因基或DA作为N

　　可鉴 的别记标m(rkear)。 ⑴基标记：基因控因性制状的现表 利用可鉴，的形别、态生等化型性表状 作记标 据连锁交换根理原分来基析因 间之的锁连系关和传遗离距绘制连 图锁谱 缺。点：因数目有基、所限构建遗 图谱不详传、标细间记的遗传距较离。大

　　㈠遗 图谱传构的建

　　⑵D NA标 每种记生DN物A有具稳性定。∴ NDA身可本为作构遗建图谱的传 记，主要标有下以种类3:型① 限 性内制切多酶态性 ②:简 序单长列多度性态 ③ 单核酸苷态多性

　　单核苷酸多③性(s态imlp nucleoeidt peloyormhpsim,s SNP)s :

　　因中基突变点数量，多中其些有可产R生LF (发生P酶在位切)点 。人基类组中的编码序列中约有因02个S万Ns标 P记非，码序编列中有约多0倍以上1的标记。

　　单核酸多苷性态 SNP位点用可寡苷分子核交杂来测检 ：*DNA芯片技术 将：不的寡同苷酸核定固在 片上芯标记待 D测N A一次就检 测很可S多NsP标； 记 特异*位等基动力学因交杂：利法用体液杂 交检测，在法标偶联反酶板应的9孔6中进行分 子杂 用一种交只双链与ND结合的A 荧染光检测 当料条两DAN子完全互分补配对 ，形时双链成NAD才时有号信检 S测PNs。DNA芯片

　　技术

　　⑴人类 因组基遗图谱传的建：构 家系析分法分析8个家：1系34个成员 (816个数减分裂 )526根4 个TS(R单重简序列)复标绘记而制(成染 X色分析是体利12家系用10个成7员[ 051减个数裂]分 将)2546标个 记位定2在33个5点?位构建人的基因 类遗组传图密谱度为每个标5记99 k。b

　　⑵ 物植

　　基因遗组图传的构建：谱

　　① 选择亲本：亲 关系远，遗传差缘异大，性本间亲子 标分多记态性。强 ②产生图构群： 配体制合?组立分建离群体:*单 交合组生产F2;的* 衍的生3F、F4系家 * 由连续；多代交自或姐交妹产生的组近交系 (重ecorbinmat nnibrd leneisR,L); I 通过单*倍加体而倍成的双单体(倍doubldehap olis,dH);D *利 回交或用交(三交)复产生后的代群体。

　　⑵ 植基因组遗物传图的谱建：构

　　③ 传标记遗的染色体定位 ：有体单三、、代换系与附加系分体析等方法，依据 染色体量的差剂?将异传标遗定位记在定 染色体特。上∵当供体 料总D材NA等时，量DA杂交N带的 号强信弱该标记位与的于色体染量剂正成。 比④标 间的记连分析锁 ：过通分析分离群内双体间有亲多性态遗的传 标的连锁记换情况交趋和于同协分的离度程 即可定确标间记连锁关系的遗传和离。

　　距

　　(二 物理)谱图的建构.1构 建理物图的谱因原： .2 构建理图物谱的三条途：径 3 人.基因组物理图类:谱

　　.1 建构理物图谱的原因：

　　⑴. 传遗图的分谱辩率有限：低等生 物可重复行多次杂交、进交测在 期短内产可生量群大、得到大量重组交换体 子的代群体 建高构度密遗的传谱图 人。类或其高它生等物以难得获大的量代子 群，减体数裂分后的有代 限限制锁连 分。析 ⑵ .遗图谱的精确传不高性 染：体色有一上重些组热点，发其生重组的 频高于其它位率点?影响组热点重近区邻段 的传遗谱准图确。性

　　常的两大类用型SS:T

　　①. 特D异A序N列 * :表的序达标签(express列d eseqenue tacgEST),表达的，序列来cDN自A。 简单*序列度多态长性(SLP)也S用可物于 图理的构谱建，较遗比图传谱物和理谱。图* D A随机片段，测N后经序分析比，较非重复序 可作列为TS。 S②D.NA段： 分片两种不同为类： 型 辐*射交杂系(adiratio nybhird )指啮： 齿物细动含胞另有个生物一染色片体段的细 胞。株

　　细胞遗传学研究表： 明用300080-00arX射线d处理 后类染 色人会出体随机断现 将处理细胞与裂正 仓鼠常其或它齿动物啮胞细合融 断的人 裂染色类可体与仓染色鼠体合融复 制利100用个人基类组因辐后射缺与仓鼠细失 胞融合成的辐形射杂交(能系在HA培养基上生 T长的是就含有类染色体人片的断胞细进 行人 类因基物理图谱的组建。

　　构

　　人 基类因物组图理谱

　　人类因基组序列开测始定，已时4有万5EST个 ，其有中些重复一列 经序算计分机筛选析 得到后9426个5,各代一表个基 因再中从筛 选出3万个ET、二S辐个射杂系交库(别有83和 分93个细胞株、一个)320有00克隆的个YCA文 用于构建库图谱。构建的物 理图谱密为度每标个记813b,ESk分 T结果布明表因基在色体染的排列是上均匀的不。将上述遗传图谱 及它物其理谱图整合构成 更加 整完人的类基组因谱，图作为因基序组测 列定的架框和分析据依。

　　二、因组图谱的应用基

　　因基图组谱中了构建遗传图除和物理谱图谱 ，还可进外步根一标记类据细分型 不为的同称谓 。如FRP图谱、LAPDR谱图A、FL P谱图等，目已在前拟芥、番南、茄水 稻等0多3植物中种建了基构图因谱 基因图谱的构。除建进了测序之外行，还 有许多途。用二、

　　4。 基因的.隆与分离 克根据和基因组图饱，谱找到可个一目 与的因紧密连基的锁分子标，作记为染色体 行步c(hormsomoewal kin)g始点起进行 因的基隆和分离克，法此亦称图位 隆克法map(b-sae cdolinn),为g基因产物 未的知因基克隆供提了径捷。

　　三后、基因学(p组ot-gsnoemci)s在成基完组因图谱建构以全及部列测序定的 础上基 研全究基组因基因功的能、基 因之间互相关和调系控制为主 要内容的机学科 。 目前人基因类计组已划将划计完成序全列 定的测间时20从5年0提到前200年。 3 2 0014月年2日，公6了布人类因基序 列架框图草。

　　、三后因组基学(osp-tenomgcs)i

　　自从196年9母菌酵因组全序列基测以来定，全 界已世1000多有实验室个50、00多名学 家科从事母菌后基因酵组学研的究，发表共文论7 000篇多，鉴定0160个新因基的功，能仍但 然还约16有00阅个读框的架能不功清楚。后 基组因学要技主： DNA术微阵技术； 列白蛋质学组 酵；母菌双交杂统； 系生信物息学技术。等

　　蛋.白组质学(rpotomecs) i

　　在白蛋质平水研究因组的基基因达 分 表基因析组的蛋质白型、数类量、空间构变异结 及相互作以的机制。用 白蛋组学质基因比组更学为杂： ∵复ND线A结构与状级结构二功的差异不 能，但大肽多需链折成叠一定三的空维间构结才 成形有功能的蛋白质；一同蛋白质种经同不的 加工饰修可成不形的功能同，因此白蛋的多质样性远 杂复于因本身。

　　基3

　　计设路思：

　　⒈当告报基(如半因乳糖酶苷因基)缺转少因子录时 于关处

　　闭状态； 将酵⒉母转菌因录子D AN结区合域和NRA激活酶域 分开区分 别隆克；⒊ 将NA结合区D域与测待目的因(蛋白质A)和基告基报因共 同串起连来形 成融基因合。同将时活激区 域列序与另一类DNA序(蛋白质X列)也连起来；串⒋将两类 融分合子转化共酵母细胞，如白质蛋能与蛋 白XA质互作结、R合A聚合N酶活激因与子启子动域 区使报基因告表达，于鉴易定。 DNA合结酵