色谱柱和色谱系统的故障检修Word

　　HPLC Column and System Troubleshooting

　　色谱柱和色谱系统的故障检修

　　What Every HPLC User Should Know

　　每个HPLC使用者应该知道什么2016/3/18 1

　　HPLC Components HPLC 的组成

　　Pump 泵 Injector/Autosampler 进样器/自动进样器 Column 色谱柱 Detector 检测器 Data System/Integrator 数据系统/积分仪表 All of these components can have problems and require troubleshooting. 所有这些部件可能出现故障而需要检修。2

　　2016/3/18

　　Categories of Column Problems 色谱 柱问题的类型

　　A. Pressure 压力 B. Peak shape 峰形 C. Retention 保留时间

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　　Pressure Issues 压力问题

　　Column Observations 色谱柱观测

　　Potential Problems 潜在的问题

　　High pressure 压力高

　　Plugged frit 堵塞滤头 Column contamination 色谱柱污染 Piugged packing 堵塞填料

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　　Determining the Cause and Correcting High Back Pressure 查出原因 纠正压力Check pressure with/without column - many pressure problems are due to blockages in the system or guard 有/无柱子时检查压力 - 许多压力问题是由于系统或保护柱的阻塞

　　If Column Pressure is high 如果柱压高:Wash column - Eliminate column contamination and

　　冲洗柱子

　　plugged packing 排除柱污染和填料堵塞 - high molecular weight/adsorbed compounds 高分子量/被吸附化合物 - precipitate from sample or buffer 样品或缓冲液中的沉淀物

　　Back flush column - Clear plugged frit 反冲柱子-清洁阻塞的滤头 Change frit - Clear plugged frit 更换滤头5

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　　Column Cleaning 柱子清洗

　　F lush with stronger solvents than your mobile phase

　　用比你的流动相更强的溶剂冲洗Reversed-Phase Solvent Choices in Order of Increasing Strength 为了增加强度选择反相溶剂Use at least 25 ml of each solvent for analytical columns 对于分析柱每种溶剂至少用25 ml 冲洗Mobile phase without buffer salts 没有缓冲盐的流动相 100% Methanol 甲醇 100% Acetonitrile 乙腈 75% Acetonitrile :25% Isopropanol 75乙腈 ： 25%异丙醇 100% Isopropanol 异丙醇 100% Methylene Chloride★ 二氯甲烷 100% Hexane ★ 已烷★

　　When using either Hexane or Methylene Chloride the column must be flushed with

　　Isopropanol before returning to your resvered-phase mobile phase.

　　当用已烷蔌二氯甲烷柱子时,必须先用异丙醇冲洗,然后再用你的反相流动相2016/3/18 6

　　Column Cleaning柱子清洗

　　Normal Phase Solvent Choices in Order of Increasing Strength为了增加强度选用正相溶剂Use at least 50 ml of each solvent 每种溶剂至少用50 ml50% Methanol : 50% Chloroform 50% 甲醇 : 50% 氯仿 100% Ethyl Acetate 乙酸乙酯7

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　　How to Change a Frit 怎样更换滤

　　头

　　Column Inlet Frit 柱进口滤头 Column Body 柱身 Compression Ferrule 压缩金属套圈Wear gloves 戴手套 Do not allow bed to dry 不要让底座干燥 Do not touch the column-body heat will extrude packing 不要使柱身受热,否则填料会喷出 Do not over tighten 不要旋得太紧

　　Female End Fitting 旋好尾端螺母 Male End Fitting 旋好尾端螺头2016/3/18 8

　　Preventing Back Pressure Problems

　　压力问题的预防

　　Use column protection 柱保护- Guard columns 保护柱/预柱

　　- In-line filters 在线过滤器

　　Sample Preparation 样品预处理 Appropriate column flushing 适当的柱冲洗 Filter buffered mobile phase 过滤缓冲流动相9

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　　Preventing Back Pressure Problems:In-Line Devices

　　压力问题的预防:在线装置Pre-Column 预柱

　　Mobile Phase From Pump 从泵来的流动相

　　Injector Filter Guard 进样器 滤头 Column 保护柱

　　Analytical Column Filter and Guard Column Act on Sample 分析柱 滤头和保护柱作用于样品 Pre-Column Acts on Mobile Phase 预柱作用于流动相 To Detector 到检测器

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　　Preventing Back Pressure Problems: Sample Preparation

　　压力问题的预防:样品制备

　　Solvent/Chemical Environment 溶剂/化学环境 Particulate/Aggregate Remove 微粒/凝聚物的除去Filter samples 过滤样品 Centrifugation 离心分离

　　Solid Phase Extraction(S.P.E.) 固相萃取Cartridges or Plates 薄膜或薄层板 Disks or Membranes 圆盘或生物膜11

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　　Peak Shape Issues 峰形问题Split peaks 裂峰 Peak tailing 峰拖尾 Broad peaks 宽峰 Poor efficiency 低柱效

　　Many peak shape issues also combinations-I.e. Broad and tailing or tailing with increased retention许多峰形问题 是结合在一起的-例如: 展宽和拖尾或拖尾和保留时间增加12

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　　Split Peaks 裂峰 Can

　　be caused by: 可能的原因:

　　Column contamination 柱污染 Partially plugged frit 部分阻塞滤片 Column void 柱头塌陷 Injection solvent effects 溶剂效应13

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　　Split Peaks 裂峰

　　Column Contamination 柱污染Column: StableBond SB-C8, 4.6 250mm, 5m Mobile Phase:60%25mM Na2HPO4,pH3.0 : 40%MeOH Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: 35 C Detection: UV 254 nm Sample: Filtered OTC Cold Medication: 1. Pseudoephedrine 2. APAP 3. Unknown 4. Chlorpheniramine

　　Injection 1 Injection 30 Injection 1

　　峰3 峰3

　　峰形较好 裂峰峰形极好14

　　After Column Wash with 100% CAN

　　经100%乙腈冲洗后 峰3

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　　Split Peaks 裂峰

　　Injection Solvent Effects 溶剂化效应Column: StableBond SB-C8, 4.6 250mm, 5m Mobile Phase: 82%H2O : 18%ACN Injection Volume: 30 L Sample: 1. Caffeine 咖啡因 2. Salicylamide 水杨酰胺A. Injection Solvent 100% Ac

　　etonitrile 峰形宽拖尾 B. Injection Solvent Mobile Phase 峰形尖锐对称

　　样品溶剂尽可能与流动相匹配2016/3/18 15

　　Determining the Cause of Split Peaks

　　裂峰原因的确定

　　1. Complex sample matrix or many samples analyzedcolumn contamination or partially plugged frit

　　likely

　　复杂样品的基质或分析许多样品 - 柱污染或部分阻塞滤片2. Mobile phase pH=7 - likely column void due to silica dissolution (unless specialty column used)

　　流动相 pH=7 - 由于硅胶溶解使柱塌陷(除非使用专门的柱子)3. Injection solvent stronger than mobile phase - likely split and broad peaks, dependent on volume

　　溶剂比流动相的可能性大- 裂峰和宽峰,由样品量来决定16

　　2016/3/18

　　Peak Tailing, Broadening and Loss of Efficiency

　　峰拖尾、变宽和柱效降低

　　Can be caused by: 可能的原因Column “secondary interactions” 柱“次级效应” Column void 柱塌陷 Column contamination 柱污染 Column aging 柱老化 Column loading 柱负荷超载 Extra-column effects 柱外效应17

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　　Peak Tailing Column “Secondary Interactions”

　　峰拖尾柱“次级效应”

　　Column: Alkyl-C8, 4.6 150mm, 5m Mobile Phase:85%25mM Na2HPO4,pH7.0 : 15%ACN Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: 35 C Sample: 1. Phenylpropanolamine 苯丙醇胺/去甲麻黄碱 2. Ephedrine 麻黄碱 3. Amphetamine 安非他明/苯丙胺 4. Methamphetamine 脱氧麻黄碱 5. Phenteramine 苯三胺No TEA 无三乙胺 USP TF(5%) 美国药典拖尾因子 1. 1.29 2. 1.91 3. 1.63 4. 2.35 5. 1.57 10 mM TEA 10 mM 三乙胺 USP TF(5%) 美国药典拖尾因子 1. 1.19 2. 1.18 3. 1.20 4. 1.26 5. 1.14

　　Peak tailing eliminated with mobile phase modifier (TEA) at pH 7

　　用流动相减尾剂(三乙胺)在pH 7 消除峰拖尾18

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　　Peak Tailing Column “Secondary Interactions”

　　峰拖尾柱“次级效应”

　　Column: Alkyl-C8, 4.6 150mm, 5m Mobile Phase:85%25mM Na2HPO4,pH7.0 : 15%ACN Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: 35 C Sample: 1. Phenylpropanolamine 苯丙醇胺/去甲麻黄碱 2. Ephedrine 麻黄碱 3. Amphetamine 安非他明/苯丙胺 4. Methamphetamine 脱氧麻黄碱 5. Phenteramine 苯三胺pH 3.0 USP TF(5%) 美国药典拖尾因子 4. 1.33

　　pH 7.0 USP TF(5%) 美国药典拖尾因子 4. 2.35

　　Reducing the mobile phase pH reduces interactions with silanols that cause peak tailing

　　降低流动相的pH ,减小与硅醇基作用引起的峰拖尾19

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　　Peak Tailing 峰拖尾

　　Column Contamination 柱污染Column: StableBond SB-C8, 4.6 250mm, 5m Mobile Phase: 20% H2O : 80% MeOH Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: R.T. Detection: UV 254 nm Sample: 1. Uracil 尿嘧啶 3. 4-Chloronitrobenzene 4-氯硝基苯 Plates TF Plates TF 理论板数 拖尾因子 理论板数

　　拖尾因子 1. 7629 2.08 1. 7906 1.43 2. 12043 1.64 2. 12443 1.21 3. 13727 1.69 3. 17999 1.19 4. 13355 1.32 4. 17098 1.25QC test forward direction QC test reverse direction

　　2. Phenol 苯酚 4. Toluene 甲苯 Plates TF 理论板数 拖尾因子 1. 7448 1.06 2. 12237 1.21 3. 15366 1.11 4. 19067 1.17QC test after cleaning 100% IPA, 35 C

　　向前方向

　　相反方向

　　100%异丙醇冲洗后20

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　　Peak Tailing/Broadening

　　Sample Load Effects

　　峰拖尾/变宽样品过载效应

　　Column: 4.6 150mm, 5m Mobile Phase:40%25mM Na2HPO4,pH7.0 : 60%ACN Flow Rate: 1.5 mL/min Temperature: 40 C Sample: 1. Desipramine 去郁敏/脱甲基丙米嗪 2. Nortriptyline 4. Imipramine 丙米嗪 5. Amitriptyline 阿米替林

　　3. Doxepin 6. Trimipramine

　　Tailing Eclipse XDB-C8 USP TF 拖尾因子 High Load / 10 Low Load 高载负/10倍 低载负1. 2. 3. 4. 5. 1.60 2.00 1.56 2.13 2.15 1.70 1.90 1.56 1.70 1.86 1.25

　　Broadening / Competitive C8 Plates 理论板数 High Load / 10 Low Load 高载负/10倍 低载负850 815 2776 2539 2735 5189 5941 7842 6231 8359 10022 10725

　　6. 1.25

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　　Peak Broadening,Splitting

　　Column Void

　　峰变宽,裂开 柱塌陷

　　Mobile Phase:流动相：50%CAN : 50%Water : 0.2%TEA (~pH 11) 50%乙腈 : 50%水 : 0。2%三乙胺 (~pH 11)After 30 injections 进样30次后 Initial 开始时

　　Multiple peak shape changes can be caused by the same column problem. In the case a void resulted from silica dissolved at high pH.

　　多数峰形改变可能是同一柱问题引起的。在这个例子中， 高pH溶解硅胶导致塌陷22

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　　Broad Peaks Unknown “Phantom” Peaks

　　Column: Extend-C18, 4.6 150 mm, 5 m Mobile Phase: 40% 10 mM TEA, pH 11 : 60% MeOH Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: R.T. Detection: UV 254 Sample: 1. Maleat 顺丁烯二酸 2. Pseudeophedrine 伪麻黄碱 3. Chlorphenniramine 氯非尼拉明

　　Plates 理论板数1. 5922 2. 9879 3. 779 “Phantom” peak from first injection 前次进样未出完的峰 The extremely low plates are an indication of an extremely late eluting peak from the preceding run.

　　极低的理论板数表明这是一个前面进样极迟洗脱出来的峰2016/3/18 23

　　Peak Tailing峰拖尾

　　Injector Seal Failure进样器密封性差Column: Bonus-RP, 4.6 75mm, 3.5m Mobile Phase: 30% H2O : 70% MeOH Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: R.T. Detection: UV 254 nm Sample: 1. Uracil 尿嘧啶 2. Phenol 苯酚 3. N,N-Dimethylaniline N,N-二甲苯胺 Plates TF Plates TF 理论板数 拖尾因子 理论板数 拖尾因子 1. 2235 1.72 1. 3670 1.45 2. 3491 1.48 2. 10457 1.09 3. 5432 1.15 3. 10085 1.00

　　Before

　　After replacing rotor seal and isolation seal

　　之前

　　转动杆和隔离密封垫检修后

　　Overdue instrument maintenance can cause pea

　　k shape problems.

　　仪器保养超期可能引起峰形问题/进样器划痕24

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　　Peak Tailing 峰拖尾

　　Extra-Column Volume 柱外死体积效应Column: StableBond SB-C18, 4.6 30mm, 3.5m Mobile Phase: 85% H2Owith 0.1% TFA : 15% CAN Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: 35 C

　　Sample: 1. Phenylalanine 3. Asp-phe

　　2. 5-benzyl-3,6-dioxo-2-piperazine 4. Aspartame

　　10 l extra-column volume

　　50 l extra-column volume

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　　Determining the Cause of Peak Tailing

　　峰拖尾原因的确定

　　Evaluate mobile phase effects - alter mobile phase pH and additives to eliminate secondary interactions 评价流动相效果 - 改变流动相pH和添加剂消除次级效应/流动相中组份 与柱子相互作用 Evaluate column choice - try column with high purity silica or different bonding technology 评价柱选择 - 试用高纯度硅胶柱或不同键合技术柱 Reduce sample load 减小进样量 Eliminate extra-column effects 消除柱外效应 Flush column and check for aging/void 冲洗柱子检查柱子老化/塌陷

　　2016/3/18

　　Retention Issues 保留时间问题

　　Retention time changes(tr)

　　保留时间改变

　　Capacity factor (retention) changes (k)

　　容量因子改变

　　Selectivity changes ( )

　　选择性改变

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　　Changes in Retention Same Column, Over Time

　　相同柱子上保留时间改变,超时

　　May be cause by: 可能的原因:Column aging 柱老化 Column contamination 柱污染 Insufficient equilibration 不够平衡 Poor column/mobile phase combination 柱/流动相组成差 Change in mobile phase 改变流动相 Change in flow rate 改变流速

　　other instrument issues 其他仪器问题28

　　2016/3/18

　　Mobile phase Change Causes Change in Retention

　　流动相改变引起保留时间改变

　　60%MeOH:40% 0.1% TFA

　　Fresh TFA Added to Mobile Phase

　　Volatile TFA evaporated/degassed from mobile phase.

　　易挥发的三氟乙酸从流动相中蒸发/挥发。Replacing it solved problem.

　　换用新的流动相就解决问题。

　　使用有机挥发性酸时，流动相应新配。29

　　2016/3/18

　　Column Aging/Equilibration Causes Retention/Selectivity Changes

　　柱老化/平衡不够引起保留时间/选择性改变

　　Column 1 - Initial 1 号柱 开始时 Column 1 - Next Day 1 号柱 第二天 Column 1 - After Cleaning with 1% H3PO4 1 号柱用 1% H3PO4 清洗

　　The primary analyte was sensitive to mobile phase aging of the column. 最初的分析对流动相老化柱子是灵敏的 The peak shape was a secondary issue resolved by flushing the column. 冲洗柱子第二要解决的问题是峰形 Retention and peak shape were as expected after cleaning. 清洗后保留时间和峰形都达到了预期效果30

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　　Determining the Cause of Retention Changes on the same Column

　　同一柱上保留时间改变原因的确定

　　1. Determine K, , and tr for suspect peaks 对 怀疑峰K, 和tr的确定 2. Wash column 冲洗柱子 3. Test new column - note lot number 试验新柱- 记录一批数据 4. Review column equilibration procedures 观察柱平衡过程 5. Make up fresh mobile phase4 and test 配制新鲜流动相再试验 6. Check instrument performance 检查仪器性能31

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　　柱与柱之间保留时间/选择性的改变

　　Change in Retention/Selectivity Column-to Column

　　Different column histories (aging)

　　不同的柱历史(老化)

　　Insufficient/inconsistent equilibration

　　平衡不够 /不一致Poor column/mobile phase combination

　　柱/流动相差

　　Change in mobile phase流动相改变

　　Change in flow rate 流速改变 Other instrument issues其他仪器问题Slight changes in column bed volume (tr only)

　　柱内体积轻微改变2016/3/18

　　Lot-to-Lot Selectivity Change (pH)

　　批与批之间选择性改变(pH)pH 3.0 - Lot 1 pH 3.0 - Lot 2

　　pH 4.5 - Lot 1 pH 4.5 - Lot 2

　　pH for pH pH

　　4.5 shows selectivity change from lot-to-lot basic compounds 4.5 显示批与批之间对碱性化合物的选择性改变 3.0 shows no selectivity change from lot-to-

　　lot, indicating silanol sensitivity at pH 4.5 pH 3.0显示批与批之间对碱性化合物的无选择性改变,表明在 pH 4.5硅醇基的灵敏性2016/3/18 33

　　Conclusions

　　结论

　　HPLC column problem are evident as:

　　高效液相色谱柱问题明显的为:High pressure 高压 Undesirable peak shape

　　不希望得到的峰形

　　Changes in retention/selectivity 保留时间/选择性的改变

　　Often these problems are not associated with the column and may be caused by instrument and experimental condition issues.

　　经常遇到的这些问题不一定与柱有关,而与仪器和 实验条件方面的问题有关34

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