丁基苯酞对低糖低氧引起神经细胞内钙升高的作用

　　DOI:10.16438/j.0513-4870.1999.12.003

　　药学学报ActaPharmaceuticaSinica1999,34(12)∶893～897

　　893

　　熊　杰,冯亦璞＊

　　(中国医学科学院,中国协和医科大学药物研究所,北京100050)

　　摘要　目的:探讨抗脑缺血新药丁基苯酞(NBP)对脑缺血过程中细胞内游离钙升高的影响及其作用机制。方法:采用低糖低氧损伤胎鼠或新生鼠神经细胞以模拟脑缺血,用Fura-2/AM作荧光指示剂,观察手性丁基苯酞对神经细胞内游离钙升高的抑制作用,并用内钙释放剂thapsigargin,外源性谷氨酸,高K+及钙离子载体A23187作工具药,对其作用环节进行分析。结果:d-,l-,dl-丁基苯酞能完全抑制低糖低氧造成的神经细胞内钙升高。手性NBP能降低thapsigargin引起的内质网钙库释放,d-NBP还对谷氨酸引起的内钙升高表现出抑制作用。结论:丁基苯酞抑制低糖低氧条件下神经细胞内钙升高的作用环节主要是抑制细胞内钙库的释放。

　　关键词　丁基苯酞;低糖低氧;细胞内钙;钙离子荧光指示剂(Fura-2/AM)

　　丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide,dl-NBP)是我所研制的抗脑缺血一类新药,药效学研究表明有良好的抗脑缺血活性[1～5]。以往在大鼠尾动脉环实验中曾发现dl-NBP能抑制去甲肾上腺素引起的细胞[Ca2+]i升高作用,而对外钙入胞无影响[6],同时大量实验还提示NBP对脑缺血时细胞内钙升高可能有抑制作用[7]。为此,我们用Fura-2/AM作为荧光指示剂[8],采用双波长荧光分光光度法,观察了低糖,低氧或低糖低氧处理对大鼠胎鼠神经细胞[Ca2+]i水平的影响及手性丁基苯酞(d-,l-NBP)和消旋丁基苯酞(dl-NBP)的作用;并用内钙释放剂Thapsigargin,外源性谷氨酸,高K+以及钙离子载体A23187作工具药,分析了NBP对[Ca]i影响的可能作用机制。

　　2+

　　10-3,10-4和10-5molL-1。Fura-2/AM,本所合成室提供,溶于DMSO成1mmolL-1溶液,-20℃分装保存。EGTA[ethyleneglycolbis-(2-aminoe-thyl-ether)tetraceticacid]购于北京化学试剂公司,溶于3molL-1Tris中,成0.5molL-1溶液。BSA和MK-801,购于Sigma公司;TritonX-100,购于香

　　港FARCO化学公司;谷氨酸,购于Serva公司,均溶于0.9%生理盐水。Thapsigargin,购于Sigma公司,完全溶解于DMSO成3mmolL溶液,-20℃分装保存,使用时以DMSO稀释。小于3μmolL-1的稀释液只可一次性使用[12]。A23187,购于Sigma公司,溶于DMSO。高糖(含D-葡萄糖4.5gL-1)和低糖(含D-葡萄糖1.0gL-1)DMEM培养基,购于GIBCOBRL公司。Hanks液(mmolL):NaCl137,KCl5,CaCl21.3,MgSO47H2O0.8,Na2HPO4H2O0.6,KH2PO40.4,NaHCO33.0,Glucose5.6,pH7.2。

　　仪器　F-4010双波长荧光分光光度计,日本Hitachi公司。

　　方法　Wistar孕鼠以10%水合氯醛(360mgkg,ip)麻醉后,取出胎鼠7～8只。将完整大脑半球置高糖DMEM中制成细胞悬液,经200目细胞筛过滤3次,经1000rmin-1离心5min,去上清液,正常对照组细胞悬浮于高糖DMEM中,低糖低氧组悬于Ar2饱和的低糖DMEM中,并以封口膜密闭。细胞数均在5106个mL-1,给药组同时加入药物,置37℃,含5%CO2环境中处理。处理后的-1,,所得

　　-1

　　-1

　　-1

　　材料与方法

　　动物　清洁级Wistar孕鼠,孕期16～18d,购于中国医学科学院实验动物繁殖中心。

　　药品与试剂　d-,l-和dl-NBP,由本所合成室杨靖华教授提供,黄色油状液体,纯度96%。先溶于少量DMSO中,再加入4倍体积双蒸水,制成10-2molL-1的混悬液,再以双蒸水依次稀释至

　　收稿日期:1999-04-26

　　基金项目:国家科委1035工程重大项目基金(94-ZD-01)和国家

　　自然科学基金重大项目基金资助项目(29790122)

　　＊

　　联系人　Tel:(010)63165173,Fax:(010)63017757,

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　　细胞重新悬浮于等体积Hanks液中,常规进行负载,清洗和细胞荧光测定。

　　观察药物作用时,神经细胞直接悬浮于Hanks液中,进行负载和荧光测定。测定前对样品和

　　DMSO均进行扫描,以消除药品和溶剂自身的荧光干扰。d-,l-或dl-NBP在工具药加入前2min加入样品池。

　　测定条件　ExWL1340nm,ExWL2380nm,EmWL500nm,Exbandpass5nm,Embandpass10nm,测定温度37℃。

　　数据处理　所测得各数据均减去细胞自发荧光值,给药组数据均减去细胞和药物自发荧光值,再代入Grynkiewicz公式[8][Ca2+]i=Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)(Sf2/Sb2),计算细胞内游离钙浓度。全部数据均采用t检验进行统计学处理。

　　平的明显升高,而较长时间(3h)的低糖低氧会引起严重的细胞内钙水平上升。其他实验表明此时细胞损伤严重,功能几乎丧失,不利于药物作用的观察,因而我们选择低糖低氧处理1h作为神经细胞损伤

　　模型,观察药物的作用。

　　2　NBP对低糖低氧所致神经细胞内游离Ca2+升高的抑制作用

　　由图1可见,d-,l-和dl-NBP对低糖低氧处理1h所致[Ca2+]i升高均有明显抑制作用。其中以l-NBP的作用最强,在0.1μmolL-1时可使升高的[Ca]i(226.61nmolL)降至165.18nmol-1-12+L,在1.0μmolL时,[Ca]i进一步降至129.09nmolL-1,基本接近正常水平(101.39nmolL)。而d-NBP在1.0μmolL时才出现类似的抑制作用,[Ca2+]i降低至161.56nmol在10μmolL-1时,[Ca2+]i恢复到接近正常水平,为134.31nmolL-1。dl-NBP的作用基本介于二者之间,也在1.0μmolL时才表现出抑制[Ca2+]i升高的作用,使[Ca2+]i由262.02降至207.65nmolL-1,在10μmolL-1时,这一数值进一步降至164.26nmolL,基本恢复正常。d-,l-和dl-NBP的作用强度均有一定的量效关系,高浓度时(10μmolL-1)3者的作用强度趋于一致,均使升高的[Ca2+]i恢复到正常水平。3者的作用表明它们对低糖低氧造成的细胞内钙升高均有较好的逆转作用

　　。

　　-1

　　-1

　　-1

　　-1

　　2+

　　-1

　　结果

　　1　低糖低氧损伤条件的确立

　　由表1可见,正常胎大鼠神经细胞[Ca2+]i水平较低,为142.3721.53nmolL

　　-1

　　;单纯低氧或

　　单纯低糖处理细胞1h,并不影响[Ca2+]i水平;而低糖合并低氧处理细胞1h,则[Ca]i明显升高。Tab1　Changesin[Ca2+]ilevelinratfetalneuronssubjectedtohypoxia,hypoglycemiaorhypoxia/hypoglycemiacomparedwithnormalgroup.Hypo:hypoxia/hypoglycemia

　　Group

　　Normal

　　Hypoxia-1h

　　Hypoglycemia-1hHypo.-0.5hHypo.-1hHypo.-3h

　　[Ca2+]i/nmolL-1142.3721.53

　　167.2323.31140.4227.17249.0251.98＊＊262.0221.61＊＊538.0474.42＊＊

　　2+

　　　 xs,n=4.＊＊P0.01vsnormal.

　　由低糖低氧处理引起神经细胞内钙升高的时间

　　曲线表明,胎大鼠神经细胞[Ca2+]i水平随低糖低氧时间的延长而持续升高。当处理时间分别为0.5h(Hyp.-0.5h),1h和3h时,细胞[Ca2+]i水平分别达到249.0251.98,262.0221.61和538.0474.42nmolL-1,与正常对照组均有明显差异。说明神经细胞对低糖低氧损伤的反应极为敏感,短时间(0.5h)的低糖低氧即可造成[Ca]i水

　　2+

　　Fig1　Effectofd-,l-anddl-NBPontheincrease

　　ofintracellularcalciuminratfetalneuronssubjectedto1h-hypoxia/hypoglycemiacomparedwithvehicle

　　＊

　　group.xs,n=4. P0.05,##(＊＊)P0.01comparedwithnormal(vehicle)group.◆Normal;

　　-1-1

　　　Vehicle;　0.1μmol　1μmol□

　　-1

　　10μmolL.

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　　3　NBP对零外钙时Thapsigargin所致胞内Ca2+升高的抑制作用

　　外钙为零时,thapsigargin在2,10和50nmolL剂量均可迅速引起内质网钙库释放,造成

　　神经细胞[Ca2+]i的升高,但作用并无明显量效关系(图2),只在给药后的1min内可以看出3种浓度下的thapsigargin作用强度稍有不同,达峰时间均在给药后1.0～1.5min,峰值均较低,最大内钙增长为43.9nmolL-1,并且作用达峰值后持续时间较短,为1.5～2.0min,随后逐渐减弱,而2nmolL-1剂量组衰减较慢,因此本实验采用该剂量作为观察

　　-1

　　药物作用的浓度。等体积DMSO对胞内钙水平未见明显作用。

　　在该条件下,d-,l-和dl-NBP对2nmolL-1Thapsigargin所致[Ca]i升高均有明显的抑制作

　　用(图3),且dl-和l-NBP的作用比d-NBP要强,在0.1μmolL-1时即表现出明显抑制作用,使[Ca2+]i增加由40.80nmolL分别降至26.48和30.92nmolL-1,在1.0和10μmolL-1浓度,亦有明显抑制作用;d-NBP的作用出现在1.0μmolL-1,[Ca2+]i净增降为35.29nmolL-1,10μmolL-1时为33.17nmolL

　　-1

　　-12+

　　。

　　Fig2　Increasingeffectofdifferentconcentrationsof

　　thapsigargin(Tha)on[Ca2+]iofneuronsinthe

　　★absenceofextracellularcalcium.n=6.()DMSO;

　　-1-1○■△

　　()Tha2nmol()Tha10nmol()

　　-1

　　Tha50nmolL.

　　Fig3　Effectofd-,l-anddl-NBPontheincrease

　　2+-1

　　of[Ca]icausedby2nmolLthapsigargininratfetalneuronsintheabsenceofextracellularcalcium.

　　＊＊

　　xs, P0.01comparedwithvehiclegroup.

　　-1-1

　　　0.1μmol□1μmol　10μmol-1L.

　　NBP的作用表现出较大差异,d-NBP能够抑制这种形式的[Ca2+]i升高,而l-NBP和dl-NBP未见明显作用。此时MK-801表现出明显抑制[Ca]i升高的作用。

　　5　NBP对外源性高K+及钙离子载体A23187引起神经细胞内钙升高的影响

　　由表3可见,KCl及A23187均可引起胎鼠神经细胞[Ca2+]i升高,其中KCl的作用较小,50mmolL-1浓度时使[Ca2+]i净增53.19nmolL-1,而钙离子载体A23187的作用极强,0.1μmolL浓度即可使[Ca2+]i净增700nmolL-1,形成严重的钙超载。d-,l-,dl-NBP在10μmolL-1水平均不能使这两种工具药引起的[Ca2+]i升高有所降低。

　　-1

　　2+

　　4　NBP对外源性谷氨酸诱导胎鼠和新生鼠神经细胞内钙升高作用的影响

　　结果见表2。200μmolL谷氨酸虽能引起胎

　　鼠(孕期16～18d)神经细胞[Ca2+]i升高,且与正常组相比也有显著性差异,但程度较小,净增值小于30nmolL-1。在谷氨酸刺激的同时给予d-,l-,dl-NBP共同处理,[Ca2+]i上升的水平并不降低,10μmolL-1dl-NBP甚至表现出略有升高的趋势。总的来说,外源性谷氨酸对胎鼠神经细胞的作用较小,NBP对此无影响,统计学差异的出现很大程度上是由于很小的标准误。

　　而谷氨酸对新生鼠(出生3d)脑的影响强于它在胎鼠脑的作用。由表2可见,200μmolL-1谷氨酸可使[Ca]i净升高约80nmolL

　　2+

　　-1

　　-1

　　。此时手性

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　　Tab2　Effectsofd-,l-anddl-NBPontheincreaseof[Ca2+]iinratfetalor

　　newbornrat(3d)neuronsinducedby200μmolL-1glutamine

　　GroupNormal

　　Vehicled-NBP

　　Concentration/μmolL-1Glutamate2000.1

　　1.0100.11.0100.11.0101.0

　　[Ca2+]i/nmolL-1

　　infetalneurons　159.283.84

　　187.233.72#

　　　186.394.36

　　185.655.29183.905.18198.417.42193.776.85198.719.47174.498.97197.827.84217.3310.46＊

　　[Ca2+]i/nmolL-1

　　innewbornneurons269.0728.28

　　345.3036.30##

　　271.8343.57＊

　　l-NBP

　　295.7176.45

　　dl-NBP

　　MK-801

　　302.2729.67244.7225.93＊＊

　　＊)

　　xs,n=4.#(P0.05vsnormal(vehicle)group.

　　Tab3　Effectof10μmolL-1d-,l-ordl-NBPon2+

　　theincreaseof[Ca]icausedbyA23187(0.1

　　-1-1

　　μmolL)andKCl(50mmolL)inthepresence

　　-1

　　of1.3mmolLextracellularcalcium

　　GroupNormalVehicled-NBPl-NBPdl-NBP

　　A23187121.3415.83813.5784.35833.9246.28892.6357.32825.0846.68

　　KCl

　　121.3415.83

　　174.5312.53171.6014.66162.379.87165.838.23

　　偏高,但NBP的这一作用是与我们以前的实验结果一致的[7];③d-,l-和dl-NBP均可部分抑制Thapsigargin引起的[Ca2+]i升高。由于thapsigar-gin的作用机制主要是通过抑制内质网膜上不依赖于IP3的Ca2+-ATPase,促进内质网释放贮存Ca2+,因而说明d-,l-和dl-NBP对内质网钙库的释放均有抑制作用。所有这些结果表明NBP对受体门控

　　(d-NBP除外)和电压门控性钙通道激活引起的[Ca2+]i升高基本无影响,其主要作用是抑制细胞内钙库的释放。

　　由于d-NBP能抑制低糖低氧造成的[Ca2+]i升高,同时还对谷氨酸所致新生鼠神经细胞[Ca2+]i升高表现出抑制作用,表明在低糖低氧时,d-NBP

　　xs,n=4.

　　讨论

　　2+

　　文献报道,缺血缺氧造成[Ca]i升高主要源于以下3种机制

　　[9～11]

　　:①能量的耗竭,导致离子稳

　　的作用至少部分是由于它抑制了NMDA受体门控型钙通道。可见dl-NBP抑制低糖低氧造成的[Ca2+]i升高,部分是由于d-NBP对NMDA受体门控型通道的抑制。实验结果还显示新生鼠脑与胎鼠脑对兴奋性氨基酸(excitoticaminoacid,EAA)的反应性不同,胎鼠脑有更强的EAA抗性,可能是由于新生鼠脑的谷氨酸受体门控型钙通道发育较完善[17]。

　　大量文献和我们已有的工作都表明,在脑缺血和低糖低氧过程中,线粒体的结构和功能都受到很大损伤,内膜通透性增大,膜电位减小,呼吸链复合酶活性降低,能量供应急剧减少,这些作用导致线粒体对钙离子的摄取和储存能力下降。由于NBP能够改善脑缺血和低糖低氧细胞内的能量供应,并直接作用于线粒体,改善其膜电位和呼吸链功能[9],推测它必将大大增强线粒体对Ca2+的摄取储存能,[2+i。态破坏,膜去极化,兴奋性氨基酸释放引起受体门控性通道激活,而引起外钙内流;②电压门控性钙通道激活,造成大量胞外钙内流;③线粒体和内质网钙库释放。

　　本实验用外源性谷氨酸,高K,钙离子载体A23187及内钙释放剂thapsigargin作工具药,分别分析了NBP对上述3种机制造成的[Ca2+]i升高的影响。①对于外源性谷氨酸所致的[Ca2+]i升高,除d-型外,dl-NBP和l-NBP均不产生抑制作用,说明l-,dl-NBP对NMDA受体的激活影响较小;②d-,l-或dl-NBP均不能抑制由高K+和钙离子载体A23187引起的神经细胞内钙升高,表明NBP对电压依赖性钙通道的激活无抑制作用,同时也不影响钙离子载体的作用。本实验中给予高K+处理后2+],++

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　　后工作的进一步证明。

　　综合以上分析,d-,l-和dl-NBP均能完全抑制由低糖低氧引起的神经细胞[Ca2+]i升高,因而减少由[Ca]i升高造成的细胞损伤,发挥其良好的

　　脑保护作用。对其作用机制研究表明NBP主要通过抑制细胞内钙库释放来降低[Ca2+]i,d-NBP还可通过抑制NMDA受体的激活来降低[Ca]i,也可能包括对能量状态的改善作用,但没有对电压依赖型钙通道的抑制作用。

　　References

　　　1　FengYP,HuD,ZhangLY.Effectofdl-butylphthalide

　　(NBP)onmousebrainenergymetabolismincompletebrainischemiainducedbydecapitation.ActaPharmSin(药学学报),1995,30∶741

　　　2　LiuXG,FengYP.Protectiveeffectofdl-3-n-butylphthalideonischemicneurologicaldamageand

　　abnormalbehaviorinratssubjectedtofocalischemia.ActaPharmSin(药学学报),1995,30∶896

　　　3　YanCH,FengYP,ZhangJT.Effectsofdl-3-n-butylphthalideonregionalcerebralbloodflowinmiddle

　　cerebralarteryocclusionrats.ActaPharmSin(药学学报),1998,12∶36

　　　4　XiongJ,FengYP.Effectsofbutylphthalideonthe

　　activitiesofcomplexesofthemitochondrialrespiratorychain.ActaPharmSin(药学学报),1999,34∶241

　　2+

　　2+

　　　5　XiongJ,FengYP.Effectofdl-butylphthalideonthe

　　expressionofHSP70mRNAandc-fosintransientcerebralischemicandreperfusedratbrain.ActaPharmSin(药学学报),1998,33∶406

　　　6　LiuXG,FengYP.Effectofdl-3-nbutylphthalideon

　　isolatedtailarterycontractionofratinducedbypotassiumchlorideandnorepinephrine.ChinJPharmacolToxicol(中国药理学与毒理学杂志),1996,10∶113　7　LinJF,FengYP.Effectofdl-3-n-butylphthalideon

　　delayedneuronaldamageafterfocalcerebralischemiaandintrasynaptosomescalciuminrats.ActaPharmSin(药学学报),1996,31∶166

　　　8　GrynkiewiczG,PoenieM,TsienRY,etal.Anew

　　generationofCa2+inindicatorswithgreatlyimprovedfluorescenceproperties.JBiolChem,1985,260∶3440　9　KriatainT,SiesjoBK.Calciuminischemiccelldeath.

　　Stroke,1998,29∶705

　　10　SiesjoBK,etal.Calciumfluxes,calciumantagonist,

　　andcalciumrelatedpathologyinbrainischemia,hypoglycemia,andspreadingdepression:aunifyinghypothesis.JCerebBloodFlowMetab,1989,9∶12711　GillandE,Puka-SundvallM,HilleredL,etal.

　　Mitochondrialfunctionandenergymetabolismafterhypoxia-ischemiaintheimmatureratbrain:involvementofNMDA-receptors.JCerebBloodFlowMetab,1998,18∶297

　　12　BicklerPE,etal.Developmentchangesinintracellular

　　calciumregulationinratcerebralcortexduringhypoxia.JCerebBloodFlowMetab,1993,13∶811

　　EFFECTSOF3-n-BUTYLPHTHALIDEONTHEINCREASEOF

　　INTRACELLULARCALCIUMINNEURONSSUBJECTEDTOHYPOXIAANDHYPOGLYCEMIAANDITSMECHANISMS

　　XiongJie(XiongJ)andFengYipu(FengYP)

　　(InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050)

　　ABSTRACT　AIM:Tostudythedecreasingeffectsandthemechanismsofd-,l-anddl-butylphthalide(NBP)onintracellularcalcium([Ca2+]i)inneuronssubjectedtohypoxiaandhypoglycemia.METHODS:NeuronswerepreparedfromfetalornewbornratbrainandFura-2/AMwasusedasfluorescenceindicatortostudytheactionsofNBPon[Ca2+]i.Thapsigargin,glutamine,KClorcalciumionporeA23187,whichcaninduceincreaseofintracellularcalcium,wereusedastooldrugstoanalyzethemechanismsoftheactionofchiralNBP.RESULTS:d-,l-anddl-NBPwereshowntosignificantlyinhibittheincreaseofintracellularcalciumcausedbyhypoxiaandhypoglycemia.However,chiralNBPwasfoundtohavenoeffectontheincreaseof[Ca2+]iinducedbythetooldrugsexceptthapsigargin.d-NBPseemedtohavesomedecreasingeffecton+glutamate.CONCLUSION:Theactionsofd-,l-anddl-NBPmightbemediatedmainlybyitsdecreasingeffectonthereleaseofcalciumfromintracellularcalciumpool.

　　　;;calcium;Fura-/