通过体细胞无性系变异获得马铃薯优良新材料

480 园艺学报，2015，42 (3)：480–488. Acta Horticulturae Sinica doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0695；http：//www. ahs. ac. cn

通过体细胞无性系变异获得马铃薯优良新材料 邹 雪，肖乔露，文安东，胡 芳，黄雪丽，王西瑶*

（四川农业大学农学院，成都 611130）

摘 要：为建立马铃薯（Solanum tuberosum L.）试管薯切片再生体系并评价其体细胞无性系变异的

应用潜力，以马铃薯品种‘米拉’的试管薯切片为外植体，通过调节培养基植物生长调节剂配比和蔗糖

浓度建立再生体系并获得再生植株；通过逆境胁迫快速筛选出优良再生株系‘M-13’，并比较其生长特性

及稳定性；利用SCOT和RAPD分子标记检测其遗传变异。结果表明：不添加蔗糖MS + 2 mg · L-1 6-BA +

0.25 mg · L-1 TDZ + 0.1 mg · L-1 2,4-D可获得最高芽分化率65.33%。与母本‘米拉’相比再生植株‘M-13’生长更为健壮，其试管苗和试管薯质量均约为母本的2倍；‘M-13’的根/冠比和叶绿素含量较母本分别

升高了112%、23.78%，而叶片可溶性磷含量和过氧化物酶POD活性则分别下降了16.36%和30.37%。SCOT

和RAPD两种分子标记均能在‘M-13’中检测到新条带或缺失条带，与母本间的遗传相似系数分别为

0.9323（SCOT）和0.9256（RAPD），表明‘M-13’的DNA发生变异但仍保持母本的大部分特性。

关键词：马铃薯；试管薯；再生体系；体细胞无性系变异；新材料

中图分类号：S 532 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0480-09

An Excellent New Potato Material Obtained by Somaclonal Variation ZOU Xue，XIAO Qiao-lu，WEN An-dong，HU Fang，HUANG Xue-li，and WANG Xi-yao*

（College of Agronomy，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China）

Abstract：To evaluate the potential applications of somaclonal variation in potato（Solanum tuberosum L.），in this study we established regeneration systems of microtuber slices in Mira by regulating combinations of plant growth regulators and sucrose concentration. The line M-13 with excellent performance was quickly screened out from regenerated plants through stress treatment，and the study on its growth characteristics and phenotype stability was performed. The molecular markers start codon targeted（SCOT）and random amplified polymorphic DNA（RAPD）were used to analyze the genetic variation of M-13. The results suggested that the bud regeneration rate could reach 65.33% of the highest value in the medium MS + 2 mg · L-1 6-BA + 0.25 mg · L-1 TDZ + 0.1 mg · L-1 2,4-D without sucrose. Both plantlet and microtuber weights of M-13 which grew stronger were about 2-fold compared with the mother plant Mira. The root/ shoot ratio and chlorophyll content of M-13 increased by 112%，23.78%，but the soluble phosphorus content and peroxidase（POD）activity in leaves decreased by 16.36% and 30.37%，respectively. The genetic similarity coefficient between M-13 and Mira analyzed by SCOT and RAPD markers were 0.9323 and 0.9256，which indicated that M-13 remains most features of mother plant Mira but occurred genetic variation. 收稿日期：2014–11–05；修回日期：2015–01–26

基金项目：现代农业产业技术体系四川薯类创新团队项目（川农业函[2014]91号）

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wxyrtl@http://wendang.chazidian.com）

邹 雪，肖乔露，文安东，胡 芳，黄雪丽，王西瑶.

通过体细胞无性系变异获得马铃薯优良新材料.

园艺学报，2015，42 (3)：480–488. 481

Key words：potato；microtuber；regeneration system；somaclonal variation；new material

由于培养环境中激素、光照等的刺激，离体培养的再生植株中存在遗传变异或表观遗传变异，称为体细胞无性系变异（Larkin & Scowcroft，1981）。这类变异不仅具有普遍性，而且变异所涉及的性状十分广泛，包括数量性状和质量性状、染色体数和结构的变异、基因突变、DNA扩增与丢失、甲基化、转座子的激活等（Phillips et al.，1994）。体细胞无性系变异具有一些自身的特点：变异性状广且致死突变率低；单基因突变多，变异后代稳定快；多拷贝重复序列基因扩增活化或失活变异丰富；变异后代基本保持原品种特性。目前，通过组织培养中的体细胞无性系变异已选育出了具有优良性状的番茄（如干物质含量高的变种DNAP9）、芹菜（如抗镰刀黄菌的品系MSU-SHK5）、玉米（如作粮食和饲料使用的变种伊单6号）、马铃薯（如褐变轻的品种White Baron）等新品种，并已进行水稻、小麦和甘蔗品种的改良（Jain，2001；刁现民 等，2002）。

马铃薯（Solanum tuberosum L.）的离体再生培养技术较为成熟，但建立的再生体系主要用于基因转化，而对再生过程中发生的体细胞无性系变异关注较少（ 王红梅 等，2008；王晓杰 等，2008；晁祥健 等，2009）。马铃薯离体再生过程中确实存在可利用的无性系变异，如利用感青枯病的马铃薯品种‘米拉’为试材，在其叶盘愈伤组织再生苗中接种青枯病菌进行初筛选，获得了R-43和R-47两株抗青枯病能力显著高于母本的材料，其过氧化物酶活性高于母本，其图谱比母本多了两条带（孙慧生，2003）。本试验中以西南地区的马铃薯主栽品种‘米拉’为材料，通过逆境胁迫快速从一系列试管薯切片的再生植株中筛选出了新材料‘M-13’，并对其株形、生长特性等作了进一步研究，同时利用分子标记SCOT（start codon targeted）和RAPD（random amplified polymorphic DNA）检测其遗传变异情况，以期为马铃薯新型种质资源的获得提供一条可行途径。

1 材料与方法

1.1 材料

马铃薯品种‘米拉’（ML）脱毒试管苗，由四川农业大学农学院马铃薯研究开发中心提供。 试验于2010—2014年在四川农业大学农学院植物生理系和成都市邛崃喜玛高科农业科技有限公司完成。

植物生长调节剂（plant growth regulator，PGR）母液过滤灭菌于–20 ℃保存备用，培养基灭菌后待温度降至60 ℃左右加入过滤灭菌的PGR。

1.2 方法

1.2.1 试管苗扩繁和试管薯诱导

剪取马铃薯‘ML’带1 ~ 2个腋芽的茎段接入扩繁培养基MS + 30 g · L-1蔗糖 + 6 g · L-1琼脂，

（22 ± 1）℃，每隔20 d剪接扩繁1pH 5.9 ~ 6.0。培养条件：16 h光/8 h暗，光强60 µmol · m-2 · s-1，

次。剪取带1 ~ 2个腋芽的茎段接入诱薯培养基MS + 80 g · L-1蔗糖 + 6 g · L-1琼脂 + 0.5 g · L-1活性

（18 ± 1）℃。取诱导60 d左右所结薯块用于再生试验。 碳，8 h光/16 h暗，光强40 µmol · m-2 · s-1，

1.2.2 从试管薯切片诱导植株再生

将直径6 ~ 8 mm的‘ML’试管薯切成厚1 ~ 2 mm的薄片，接种在不同植物生长调节剂组合的

（20 ± 1）℃，诱导培养基（表2）上，重复4皿，每皿20 ~ 25片。16 h光/8 h暗，60 µmol · m-2 · s-1，

Zou Xue，Xiao Qiao-lu，Wen An-dong，Hu Fang，Huang Xue-li，Wang Xi-yao.

An excellent new potato material obtained by somaclonal variation.

482 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：480–488. 7 ~ 10 d后剪去从芽眼长出的芽（为原有的腋芽，非再生芽），以后每15 d换1次培养基，并观察记录。絮状率（%）=（边缘絮化的切片数/接种的切片数）× 100；芽分化率（%）=（再生出芽的切片数/接种的切片数）× 100。另将试管薯切片接种在植物生长调节剂组合8号但不添加蔗糖的培养基上，标为8*，以比较蔗糖对芽分化的影响。

1.2.3 抗逆材料的获得及生长特性比较

随机剪取8*号培养基中再生的植株，共计30个株系，扩繁后剪取顶端接于低磷（P 0.125 mmol · L-1，调节KH2PO4）MS培养基，带腋芽的第二节段接入盐胁迫（100 mmol · L-1 NaCl）MS培养基，每盒9株，每处理2盒。根据长势筛选，将表现最好的株系命名为M-13。

在MS培养基中扩繁M-13和其母本ML（每瓶12株），15 d时测定试管苗的生物量、株高、根长，以瓶为单位统计，各测3瓶；同时测定叶绿素和可溶性磷含量、过氧化物酶POD活性，各3

，次重复。向培养瓶中添加诱薯液（每瓶30 mL，MS + 80 g · L-1蔗糖 + 2 mg · L-1 6-BA + 6 mg · L-1 B9）

（18 ± 1）℃，黑暗诱导培养60 d后测定试管薯质量。

叶绿素含量采用丙酮—乙醇混合液浸提比色法，磷含量采用磷钼蓝比色法，POD活性采用愈创木酚法测定（熊庆娥，2003）。

将萌芽的ML和M-13试管薯种植到大棚中，使用基质为腐熟菌渣，浇灌1/4MS矿质营养液，60 d时对比形态和结薯差异。

试验数据采用Excel、DPS v3.01软件分析，用SSR法分析处理间的差异。

1.2.4 M-13的遗传变异检测

剪取ML和M-13的试管苗叶片约0.1 g，采用CTAB法提取DNA并调节浓度约50 ng · μL-1，从上海生工订购引物SCOT 12条（Gorji et al.，2011）和RAPD 18条（Ehsanpour et al.，2007；邸宏 等，2008；Abou-Taleb et al.，2010）（表1）。PCR反应体系25 μL：ddH2O 17.7 µL，10× PCR buffer

1.0 µL，dNTP Mixture （2.5 mmol · L-1 each）2.0 µL，DNA模板（50 ng）2.5 µL，引物（10 µmol · L-1）

1.0 µL，Taq酶（2.5 U · μL-1）0.8 µL。加入96孔板中，最后每孔加入20 μL 石蜡油防挥发。SCOT的PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，49 ℃退火60 s，72 ℃延长120 s，35个循环；72 ℃10 min。RAPD的PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，37 ~ 42 ℃退火60 s，72 ℃延长90 s，35个循环；72 ℃ 10 min。

表1 试验所用RAPD和SCOT引物序列

Table 1 SCOT and RAPD primer sequences used in this study

引物名称 引物序列 引物名称 引物序列 Primer code Sequence Primer code Sequence

SCOT01 5′ CAACAATGGCTACCACCA 3′ SCOT12 5′ ACGACATGGCGACCAACG 3′

SCOT02 5′ CAACAATGGCTACCACCC 3′ SCOT13 5′ ACGACATGGCGACCATCG 3′

5′ ACGACATGGCGACCACGC 3′ SCOT03 5′ CAACAATGGCTACCACCG 3′ SCOT14

SCOT04 5′ CAACAATGGCTACCACCT 3′ SCOT16 5′ ACCATGGCTACCACCGAC 3′

SCOT05 5′ CAACAATGGCTACCACGA 3′ SCOT33 5′ CCATGGCTACCACCGCAG 3′

SCOT11 5′ AAGCAATGGCTACCACCA 3′ SCOT36 5′ GCAACAATGGCTACCACC 3′

RAPD K09 5′ TGGGGGACTC 3′ RAPD C06 5′ GAACGGACTC 3′

RAPD K13 5′ CTCAGTCGCA 3′ RAPD O03 5′ TTAGCGCCCC 3′

RAPD K16 5′ CTGAGACGGA 3′ RAPD O18 5′ AGGTGACCGT 3′

RAPD K17 5′ GGAAGTCGCC 3′ RAPD O20 5′ TTGCCTTCGG 3′

RAPD K18 5′ TGTAGCTGGG 3′ RAPD F05 5′ ACTTGGCGGCCT 3′

RAPD J01 5′ CCCGGCATAA 3′ RAPD S89 5′ CTGACGTCAC 3′

RAPD J10 5′ AAGCCCGAGG 3′ RAPD S105 5′ AGTCGTCCCC 3′

RAPD I20 5′ AAAGTGCGGG 3′ RAPD S126 5′ GGGAATTCGG 3′

RAPD C05 5′ GATGACCGCC 3′ RAPD S304 5′ CCGCTACCGA 3′

邹 雪，肖乔露，文安东，胡 芳，黄雪丽，王西瑶.

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以Gel Red为染色剂，2.5%琼脂糖，PCR产物上样量8 µL，1× TAE为缓冲液，120 V电泳约40 min后用凝胶呈像系统（Bio-Rad，USA）检测条带。各引物重复2次PCR，若谱带结果相同，则开始统计，若结果不同则再重复PCR，直到出现可重复的谱带。谱带按0/1系统记录，只统计清晰的条带，模糊条带不作统计。

，其中采用Nei和Li（1979）的方法进行数据分析，计算遗传相似系数GS = 2Nab/（Na + Nb）

Nab为材料a和材料b共有的条带数，Na和Nb分别为材料a和材料b的条带数。

2 结果与分析

2.1 试管薯切片再生体系建立

2.1.1 植物生长调节剂组合对试管薯切片再生的影响

试管薯切片在培养基上生长约7 d后，去除从芽眼中长出的芽，因这些植株都不是通过细胞脱分化和再分化形成的，并且会影响再生。培养约14 d后，一些处理出现从薯皮开始迅速向内扩展的絮化现象，严重时可将整个切片包裹并且不会形成愈伤组织或芽。如表2所示，培养基中含IAA的1 ~ 3号处理絮化最严重，而不含IAA的处理絮化率很低。由此可见‘ML’薯块切片离体培养的絮化程度与IAA的加入密切相关，当培养基中无IAA时，其絮化率普遍不高。

培养约45 d后，1 ~ 7号处理均无芽长出，8 ~ 11号均以直接方式再生1 ~ 2个芽，无丛生芽形成。从表2可以看出，细胞分裂素/生长素（C/A）的比值变化与芽分化率密切相关，当比值较低时（1.99 ~ 10.04）基本无芽分化，而比值达到22.13时芽分化率达到最高值，进一步升高则芽分化率下降。此外，由处理10和11的对比可以看出不同种类的细胞分裂素6-BA和TDZ的互换对‘ML’芽分化并无明显影响，而处理6和7表明若C/A不合适即使加入GA3也不能促进芽的分化。

2.1.2 蔗糖对试管薯切片再生的影响

在多种植物生长调节剂组合处理芽分化率普遍不高的情况下，考虑去除培养基中的蔗糖（因为薯片中糖含量较高）。结果表明，8*号培养基（无蔗糖）芽分化效率提高到65.33%（表2），切片表面迅速转为嫩绿色，无任何絮状物，培养28 d后切片大多开始长出绿色芽点和小芽。再培养14 d左右芽可长达2 cm，生长较为正常。将芽剪下接入无激素MS普通培养基中培养7 d左右均能正常生根。

表2 PGR组合对试管薯切片再生的影响

Table 2 Effect of plant growth regulator on regeneration of microtuber slices

编号 （ZT + 6-BA + TDZ）/培养基（mg · L）Medium

No. （2,4-D + IAA） ZT 6-BA TDZ 2,4-D IAA GA3

1 2.0 0.5 0 0 1.0 0.2 1.99

2 1.0 1.0 0.25 0 0.5 0.2 3.43

3 1.0 1.0 0.25 0 0.2 0.2 8.88

4 1.0 1.0 0.25 0 0 0 –

5 0 2.0 0 0.2 0 0 9.81

6 0 0 1.0 0.1 0 0.2 10.04

7 0 0 1.0 0.1 0 0 10.04

8 0 2.0 0.25 0.1 0 0 22.13

8* 0 2.0 0.25 0.1 0 0 22.13

9 0 4.0 0.5 0.1 0 0.1 41.76

10 0 3.0 0.25 0.05 0 0.05 63.89

11 0 1.0 3.0 0.05 0 0.05 79.84

注：* 无蔗糖。不同小写字母表示处理间在0.05水平上差异显著。

Note：* Without sucrose. Different lowercase letters showed significant difference between treatments at the 0.05 level. 絮化率/% Floc rate 100 ± 0 a 85.11 ± 5.28 b 81.33 ± 4.65 b 12.59 ± 3.01 c 10.80 ± 3.21 c 5.68 ± 1.25 cd 0 f 4.98 ± 9.23 de 0 f 3.17 ± 7.28 def 0 f 1.67 ± 7.46 ef 芽分化率/% Shoot differentiation rate 0 d 0 d 0 d 0 d 0 d 0 d 0 d 20.38 ± 2.84 b 65.33 ± 2.12 a 9.68 ± 0.27 c 10.76 ± 2.01 c 11.27 ± 2.32 c

Zou Xue，Xiao Qiao-lu，Wen An-dong，Hu Fang，Huang Xue-li，Wang Xi-yao.

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2.2 抗逆株系的筛选和M-13的试管苗特性比较

2.2.1 再生优化株系的快速筛选

剪取从8*号培养基上再生的植株约30个，按株系扩繁后接入低磷和盐胁迫培养基中，选取形态长势最好的株系，命名为M-13。在低磷胁迫下，对照母本ML生长瘦弱，叶片小，叶色深绿，呈现典型的缺磷症状（图1，ML，–P）；再生株系M-13生长较健壮且叶片大而厚，叶色也为深绿色，表明也受到了缺磷胁迫（图1，M-13，–P）。在盐胁迫下，ML的腋芽几乎不能生长，叶片发黄，根系生长缓慢（图1，ML，+ NaCl）；M-13的腋芽大多能长成植株，叶色基本保持为绿色且根系生长较旺盛（图1，M-13，+ NaCl）。

图1 M-13及其母本ML在低磷（–P）和盐（+ NaCl）胁迫下的生长情况

Fig. 1 The growth of M-13 and ML（mother plant）in low phosphorus（–P）and salt（+ NaCl）stress treatment

2.2.2 M-13生长特性比较

在正常MS培养基中，接种培养7 d后，M-13叶片和茎杆均比其母本ML生长更健壮，根系也更为发达，但株高差异不明显（图2，A、B）。

图2 M-13与其母本ML试管苗形态比较

A：生长7 d试管苗地上部；B：生长7 d试管苗根系；C：生长15 d，箭头示复叶；D：在含3%甘露醇的培养基中保存80 d，

N5-48是与M-13、ML无关的另一材料，作对比。

Fig. 2 Morphological comparison of plantlets between M-13 and ML（mother plant）

A：Aerial part of seedling in test tube growth 7 d；B：Root of seedling in test tube growth 7 d；C：Growth 15 d，arrows indicated compound leaves. D：Growth 80 d in the medium with 3% mannitol to save materials，as another contrast，N5-48 has not any relationship with M-13 and ML.