莲藕可溶性淀粉合成酶基因LrSSS的克隆与表达特性分析

496 园艺学报，2015，42 (3)：496–504. Acta Horticulturae Sinica doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0906；http：//www. ahs. ac. cn

莲藕可溶性淀粉合成酶基因LrSSS的克隆与表达特性分析

张 莉，印 荔，杨见秋，程立宝，李良俊*

（扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州 225009）

摘 要：以莲藕品种‘美人红’叶片为试材，利用RACE结合RT-PCR技术克隆得到全长4 080 bp的

莲藕可溶性淀粉合成酶基因（LrSSS）cDNA序列（GenBank登录号：KP201636），其中开放阅读框3 696 bp，编码1 231个氨基酸；该序列与甜瓜、葡萄SSS基因编码氨基酸序列同源性较高，分别达79%、69%。LrSSS

所编码的氨基酸序列包含3个典型的碳水化合物结合结构域（CBM_25）和1个淀粉合成酶催化域

（Glyco_transf_5）。LrSSS 表达分析表明，莲藕根状茎膨大具3节段时，在终止叶叶片中的表达量最高，

其次为后把叶叶片，终止叶叶柄表达量最少；在根状茎膨大至4节段时，LrSSS在第1、2节段根状茎中表

达量较高，在第3、4节段根状茎中表达量较低，表明在第1、2节段根状茎形态基本建成后LrSSS在调控

产物转化为淀粉过程中可能起到重要作用。

关键词：莲藕；淀粉；LrSSS；克隆；表达

中图分类号：S 645.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0496-09

Cloning and Expression Profiling Analysis of Soluble Starch Synthase Gene in Lotus Rhizome

ZHANG Li，YIN Li，YANG Jian-qiu，CHENG Li-bao，and LI Liang-jun*

（School of Horticulture and Plant Protection，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China）

Abstract：The soluble starch synthase gene（LrSSS）was cloned from‘Meirenhong’，a species of lotus rhizome based on reverse transcription polymerase chain RT-PCR and RACE methods with leaf as template in the present study. The full-length of LrSSS（GenBank accession number KP201636）was 4 080 bp in nucleotide containing an open reading frame of 3 696 bp which encoding 1 231 amino acid. Phylogenetic analysis showed that LrSSS had 79%，69% homolog with melon，grape respectively. LrSSS contained three typical carbohydrate domains（CBM_25）and one catalyzing domains（Glyco_transf_5）relevant to starch synthesis. The expression in different temporal and spatial of LrSSS was determined by RT-PCR method. The results was that LrSSS showed the highest expression in the last leaf，and then followed by the stalk of the penultimate leaf，the lowest expression was found in the the stalk of the last leaf. In addition，the expression of LrSSS was higher in the first and second internodes than in the third and fourth internodes of rhizome，suggesting that LrSSS might play an important role in starch synthase processes.

收稿日期：2014–12–15；修回日期：2015–02–01

基金项目：江苏省科技支撑计划项目（BE2013388）；江苏省普通高校研究生科研创新计划项目（CXLX13-918）

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：ljli@http://wendang.chazidian.com）

张 莉，印 荔，杨见秋，程立宝，李良俊.

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Key words：lotus rhizome；starch；LrSSS；clone；expression

莲藕（Nelumbo nucifera Gaertn）是睡莲科莲属多年生宿根水生草本植物（赵有为 等，1999），原产中国和印度（中国蔬菜栽培学，2009），是中国栽培面积最大的特色水生蔬菜。莲藕含丰富的淀粉、矿质营养和维生素等，具有很好的营养保健功能（Takagi et al.，2003）。长期以来，中国的莲藕加工产品速冻藕、盐渍藕等畅销日、韩、欧美等国家和地区，已成为中国重要的出口蔬菜之一（李良俊 等，2003）。

淀粉是莲藕的主要贮藏物质，占干物质量的70%以上，由直链淀粉和支链淀粉组成（李海普 等，2010），其含量、组成和性质直接影响莲藕的食用和加工品质。植物直链淀粉和支链淀粉的长链统称表观直链淀粉（Apparent amylose content，AAC）；其含量的增加将伴随着淀粉糊化温度的增加和峰值粘度的降低（舒庆尧 等，1998；Jane et al.，1999）。在表观直链淀粉含量较高的莲藕品种中，成熟期淀粉的粘度较低，淀粉不易糊化，适于用作加工脆嫩爽口的盐渍藕、速冻藕等产品（李良俊 等，2006）。植物支链淀粉是由葡萄糖单元以α–1,4–糖苷键和α–1,6–糖苷键共同连接形成的有序分支的多聚物，支链淀粉中没有分支的葡聚糖链称为A链，具有1个或多个分支的葡聚糖链称为B链，A链以其还原端通过α–1,6–糖苷键连接在B链上，支链淀粉分子只有1个还原性末端分子，其侧

。可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase，SSS）链上的末端均属非还原端（高振宇 等，2004）

可通过α–1,4–糖苷键将腺苷二磷酸葡萄糖（Adenosine diphosphate glucose，ADPG）中的葡萄糖加到侧链的非还原性末端，延伸支链淀粉的分支链，形成支链淀粉的长链（谭彩霞 等，2008）。本试验中以莲藕主栽品种‘美人红’为材料，克隆得到可溶性淀粉合成酶基因（LrSSS），并对该基因在不同组织和根状茎不同节段的表达特性进行分析，为进一步探明LrSSS在莲藕淀粉合成过程中的调控作用和机制，以及为莲藕淀粉品质的分子辅助育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2012—2014年在扬州大学进行。试

材为莲藕主栽品种‘美人红’，种植于扬州大学

水生蔬菜试验基地，常规栽培管理。

2012年8月选择生长健壮植株的嫩叶经液

氮处理后置–80 ℃冰箱保存，备用于cDNA克

隆。

2013年7月，莲藕根状茎膨大具3个节段

时，取根状茎及其后把叶叶片和叶柄、终止叶叶

片和叶柄（图1）；于2013年9月，在根状茎膨

大至具4个节段时，从率先膨大的节段（后把叶

着生节段）开始向前依次定为第1、2、3、4节，

分别取样。各样品立即经液氮处理后置–80 ℃

冰箱保存，备用于基因表达分析。

图1 莲藕植株示意图 Fig. 1 The diagram of lotus rhizome

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1.2 方法

1.2.1 LrSSS cDNA 3′和5′端序列的获得

采用改良的CTAB法（淦国英 等，2009）提取RNA。使用3′-Full RACE Core Set Ver2.0试剂盒、5′-Full RACE Kit试剂盒（TAKARA公司）进行反转录，合成cDNA（具体合成过程及条件完全参照试剂盒说明）。

2012年7月20日取莲藕发育过程不同膨大时期的根状茎等量混合，由深圳华大基因研究院用Illumina HiSeqTM 2000测序技术对其进行转录组测序，拼接和组装过程详见http：//www. genomics. cn/index. php。通过blastx对基因进行同源性比对，从中得到LrSSS cDNA序列片段。

利用RACE结合RT-PCR技术，克隆莲藕可溶性淀粉合成酶基因3′端和5′端序列。根据上述转录组测序得到的LrSSS cDNA序列片段，利用Primer 5软件设计3′端和5′端RACE引物。反应体系参考TaKaRa公司的3′和5′试剂盒步骤进行操作。将回收的PCR产物连接至pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.2 LrSSS RT-PCR分析

利用半定量PCR技术对LrSSS的表达特征进行分析。根据莲藕LrSSS的cDNA序列，利用软件Primer 5设计特异引物，上游引物：5′-ACTGTCAGGGTTCCATTG-3′，下游引物：5′-GTCTTTCCCG TGCTGTTA-3′。利用β-actin作为半定量表达内参引物，上游引物：5′-GACTCTGGTGATGGTGT-3′，

94 ℃ 3 min；下游引物：5′-CACTTCATGATGGAGTTGT-3′，扩增片段长度为370 bp。PCR反应条件为：

94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。

琼脂糖凝胶电泳检测后，用Image J软件对电泳条带进行定量分析，测定其灰度值，LrSSS的相对表达量为其电泳条带的灰度值与内参基因β-actin的电泳条带灰度值的比值，然后对数据进行分析。本试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 LrSSS cDNA全长序列分析

根据LrSSS cDNA中间序列片段设计引物，采用3′ RACE技术扩增得到一条长度为465 bp的基因序列（图2，A）；5′ RACE技术扩增得到1条长度为453 bp的基因序列（图2，B）。将序列与转录组测序得到的LrSSS cDNA中间序列进行拼接，得到全长为4 080 bp的LrSSS cDNA序列（GenBank登录号：KP201636），包含3 696 bp的开放阅读框（ORF），共编码1 231个氨基酸（图3）。

图2 LrSSS 3′端（A）和5′端（B）PCR产物

Fig. 2 PCR product of 3′ cDNA（A）and 5′ cDNA（B）of LrSSS

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图3 莲藕LrSSS cDNA序列及其推测氨基酸序列

单下划线为5′RACE获得的cDNA片段，双下划线为3′RACE获得的cDNA片段。

Fig. 3 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of LrSSS in lotus lotus rhizome

The fragment of cDNA produced by 5′ RACE are indicated with single underline，the fragment of cDNA produced by 3′ RACE are

indicated with double underlines.

2.2 LrSSS基因序列分析

将莲藕LrSSS与其他植物的SSS基因的氨基酸序列在MEGA5软件中进行比对和基于Neighbor- Joining算法的系统进化树进行分析，结果显示莲藕LrSSS与甜瓜SSSIII、葡萄SSSIII等同源性较高（图

4）。

图4 植物SSS基因编码的氨基酸的聚类分析

Fig. 4 Phylogenetic analysis of SSS from different plant species