不同温度预处理对青花菜小孢子胚胎发生的影响

园艺学报，2015，42 (3)：563–568.

Acta Horticulturae Sinica doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0469；http：//www. ahs. ac. cn 563 不同温度预处理对青花菜小孢子胚胎发生的影响 孙继峰，方智远，袁素霞，李占省，杨丽梅，庄 木，张扬勇，孙培田，刘玉梅*

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

摘 要：以青花菜（Brassica oleracea L. var. italica Plenck）‘B908’和‘B1092’为材料，通过荧光

染色技术对经25、4、32.5和（4→32.5）℃等不同温度预处理的小孢子的分裂方式进行观察，并对出胚

率进行统计。结果表明，不同温度预处理的小孢子胚胎发生途径基本相同，均以对称分裂产生胚胎的孢

子体发育途径为主（B途径），经历球形胚、心形胚、鱼雷胚，最终形成子叶形胚状体。但是不同温度预

处理的小孢子启动胚胎发生的频率不同，（4→32.5）℃预处理后的成胚率最高。

关键词：青花菜；游离小孢子培养；发育途径；出胚率

中图分类号：S 635 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0563-06

Effect of Different Pre-treated Temperatures on the Microspore Embryogenesis in Broccoli

SUN Ji-feng，FANG Zhi-yuan，YUAN Su-xia，LI Zhan-sheng，YANG Li-mei，ZHUANG Mu，ZHANG Yang-yong，SUN Pei-tian，and LIU Yu-mei*

（Institute of Vegetable and Flowers of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：B908 and B1092 of broccoli（Brassica oleracea L. var. italica Plenck）were used to be the materials in the research on microspore embryogenesis. The nuclear division patterns and embryo development efficiency of isolated microspores of broccoli pretreated at different temperatures were investigated under a fluorescence microscopy by using DAPI staining. Four pretreated temperatures were 25 ℃，4 ℃，32.5 ℃，or 4 ℃→32.5 ℃（combined treatment）. The results showed that the nuclear division patterns were much the same under different temperature pretreatment. The B pathway started from symmetrical division that was the main pathway. The cotyledons-shaped embryo was formed after different developmental stages，microspore divided equally，multicellular structure packaged by the exine，original embryoid，globular embryoid，heart-shaped embryoid，torpedo-shaped embryiod，cotyledons- shaped embryoid. The embryoid development efficiency of isolated microspores of broccoli pretreated at different temperatures was different. The combined treatment（4 ℃→32.5 ℃）induced the highest frequency of microspore derived embryo.

Key words：broccoli；isolated microspore culture；pathway；embryogenesis yield

收稿日期：2014–10–06；修回日期：2015–02–09

基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-25-A）；国家自然科学基金项目（30871708）；国家科技支撑计划课题（2013BA D01B04）；国家高新技术发展计划（‘863’）项目（2012AA100105）；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：liuyumei@http://wendang.chazidian.com）

Sun Ji-feng，Fang Zhi-yuan，Yuan Su-xia，Li Zhan-sheng，Yang Li-mei，Zhuang Mu，Zhang Yang-yong，Sun Pei-tian，Liu Yu-mei.

Effect of different pre-treated temperatures on the microspore embryogenesis in broccoli.

564 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：563–568.

自青花菜（Brassica oleracea L. var. italica Plenck）游离小孢子培养获得成功以来（Takahta & Keller，1991；张德双 等，1998），对该技术的研究不断深入，使技术体系逐步得到建立和优化（方淑桂 等，2005；袁素霞，2009；冯翠 等，2011）。但是并非所有的青花菜材料都能通过小孢子培养而出胚，小孢子出胚情况受基因型、预处理温度等内外因素的影响较大。明确不同温度预处理条件下小孢子胚胎发生的途径，对从细胞学水平上深入研究小孢子胚胎发生机理，提高出胚率，具有重要理论意义和实际应用价值。

游离小孢子培养通常是利用合适的技术手段阻断小孢子的配子体发育途径，使其转向孢子体发育途径，并最终形成胚状体。胚胎发生途径受基因型、温度、小孢子发育阶段等因素的影响（朱至清 等，1978），可能的途径包括A、B、C、D、E等5种（Aionesei et al.，2005），其中报道最多的是B途径，该途径是指小孢子核均等反复分裂形成细胞团。李菲等（2006）通过4’,6–二脒基–2–苯基吲哚（DAPI）染色，观察大白菜小孢子的胚胎发生过程，发现高温预处理条件下大白菜小孢子胚胎发生以B途径为主。崔群香等（2012）通过FDA染色法，对白菜的胚胎发生做了研究，认为在高温处理条件下白菜小孢子胚胎发生以B途径为主，同时也存在A、E途径。目前对青花菜游离小孢子胚胎发生途径的研究未见报道。

本研究中以青花菜为试材，通过荧光显微观察，明确小孢子经不同温度处理后胚胎发生的过程和启动胚胎发生的频率，从而为小孢子培养技术的优化和有效应用提供生物学基础和指导。 1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2011—2013年在中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行。试验材料为青花菜易出胚材料‘B908’和不易出胚材料‘B1092’，均为杂交种。7月上旬播种，8月上旬定植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所南圃场露地，10月底种株移植到温室，于12月至翌年4月取合适花蕾材料进行游离小孢子培养和花粉成熟过程观察。

1.2 预处理温度的设置

对照：小孢子游离后直接在25 ℃暗培养25 d；处理1：小孢子游离后，先在32.5 ℃热激暗培养1 d，之后再转入25 ℃继续暗培养25 d；处理2：将花蕾于4 ℃低温预处理1 d，之后将小孢子游离，置于25 ℃条件下暗培养25 d；处理3：将花蕾于4 ℃低温预处理1 d，之后将小孢子游离，在32.5 ℃热激暗培养1 d，再转入25 ℃继续进行暗培养25 d。每处理设3次重复，每重复30皿。

1.3 小孢子培养

选取含单核晚期和双核靠边期小孢子的花蕾，75%酒精消毒30 s后，用7%次氯酸钠消毒12 min，无菌水漂洗5 min，重复漂洗3次。将花蕾放在无菌研钵中，加入B5培养基，用研棒轻轻挤压，小孢子从花粉中游离后，通过400目尼龙筛网过滤，收集滤液，以900 r · min-1离心5 min，重复3次。

mL-1，加1%活性炭（Ac）调匀后分装到用1/2NLN培养基调节小孢子浓度到1 × 105 ~ 2 × 105个 ·

60 mm培养皿中，每皿2.5 mL，封口后，按照不同的处理进行游离小孢子培养。

1.4 小孢子发育过程观察和小孢子胚胎发生频率统计

采用DAPI（4’,6–二脒基–2–苯基吲哚）荧光染色法对小孢子胚胎发生和花粉发育过程进行

孙继峰，方智远，袁素霞，李占省，杨丽梅，庄 木，张扬勇，孙培田，刘玉梅.

不同温度预处理对青花菜小孢子胚胎发生的影响.

园艺学报，2015，42 (3)：563–568. 565 观察。DAPI购自Sigma公司，用蒸馏水配成1 mg · mL-1，之后用1× PBS（磷酸盐缓冲液）稀释成10 μg · mL-1。小孢子培养过程中每天进行观察。取不同大小的花蕾置于滴有DAPI染液的载玻片上，挤出花粉中的小孢子，采用DAPI染色，制作切片，随机观察5个视野。

不同温度处理的小孢子在经过温度处理后继续在25 ℃培养至25 d，每重复随机选取3皿（每皿3蕾），重复3次，统计子叶形胚状体和非子叶形胚状体。小孢子出胚率 = 出胚总数/花蕾数。 2 结果与分析

2.1 不同温度处理条件下小孢子胚胎发生途径

在25 ℃直接培养的对照试验中，小孢子在整个培养过程中外形上没有明显变化，染色观察也没有发现明显的变化。

处理1中32.5 ℃高温处理1 d后，在两份材料中均观察到明显膨大的小孢子，且细胞核明显变大；转入25 ℃培养1 d后，观察到有均等分裂小孢子出现（图1，A）；培养2 d后，均等分裂小孢子增多，同时有少量非均等分裂小孢子出现（图1，B）；培养3 d后出现四细胞团，四细胞团的形态有平面四细胞、立体四细胞以及线性四细胞3种；5 d时出现多细胞团（图1，C），并观察到其他不同阶段的细胞、细胞团；培养8 d后出现肉眼可见颗粒（图1，D）；9 d后观察到比较规则的球形胚状体（图1，E）；11 d后观察到心形胚状体（图1，F）；13 d后观察到鱼雷胚状体（图1，G）；16 d后有子叶形胚状体出现（图1，H）；25 d时有大量子叶形胚状体和非子叶形胚状体出现。

处理2中，4 ℃低温处理后小孢子胚胎发生与高温处理有所不同，主要表现为膨大细胞的数量以及发育进程时间的长短方面。低温处理1 d后，小孢子外形没有明显变化，25 ℃培养2 d后观察到细胞膨大并有均等分裂和不均等分裂的细胞，4 d后观察到四细胞团，6 d后观察到多细胞团，10 d后观察到球形胚状体，心形胚状体和不规则细胞团，肉眼条件下可见微小颗粒，14 d后观察到鱼雷形胚状体，16 d后观察到子叶形胚状体，25 d时有子叶形胚状体胚和非子叶形胚状体大量出现。

处理3中，4 ℃低温预处理1 d后，32.5 ℃处理，小孢子胚胎发生途径与32.5 ℃处理基本相同，差别在于4 ℃与32.5 ℃组合处理条件下，膨大细胞数量更多，是32.5 ℃单独处理的2倍左右。在处理1和处理3观察过程中除了一些无规则细胞团外，还观察到一些有规则形状的细胞团和胚状体（图1，I ~ L），包括几个细胞组成的类胚结构（图1，I），几个细胞组成的具柄细胞团（图1，J），具柄胚状体（图1，K、L）。

2.2 小孢子花粉发育途径

不同时期的花粉经DAPI染色后，采用荧光显微镜观察花粉发育过程。花粉母细胞经过减数分裂后形成的四分体（图2，A）释放后，形成小孢子。早期小孢子体积小，颜色淡，细胞核位于中央。之后小孢子体积增大，颜色加深，细胞核位于中央（图2，B）。此两个阶段都属于单核早期。随后，细胞中出现液泡，随着液泡的增大，细胞核移向细胞壁，花粉萌发沟清晰可见，此阶段称为单核晚期，也是单核靠边期（图2，C）。进入单核靠边期后，小孢子细胞核进行1次分裂，形成1个生殖核和１个营养核，花粉接近圆形，进入双核期（图2，D）。双核期营养核体积大，染色较浅，位于中央，生殖核靠近细胞壁，染色较深。随着花粉发育，生殖核移向花粉中央，随后进行1次分裂，形成2个核，此时的花粉具有1个营养核和2个生殖核，处于成熟花粉阶段（图2，E、F）。

Sun Ji-feng，Fang Zhi-yuan，Yuan Su-xia，Li Zhan-sheng，Yang Li-mei，Zhuang Mu，Zhang Yang-yong，Sun Pei-tian，Liu Yu-mei.

Effect of different pre-treated temperatures on the microspore embryogenesis in broccoli.

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图1 青花菜小孢子培养胚胎发生过程

A：均等分裂的小孢子；B：非均等分裂的小孢子；C：孢子壁包裹的多细胞结构；D：类胚结构；E：球形胚状体；

F：心形胚状体；G：鱼雷形胚状体；H：子叶胚状体；I ~ L：其他类型胚状体。

Fig. 1 Microspore embryogenic development of broccoli

A：Equally divided microspore；B：Unequally divided microspore；C：Multicellular structure packaged by the exine；

D：Original embryoid；E：Globular embryoid；F：Heart-shaped embryoid；G：Torpedo-shaped embryoid；

H：Cotyledons-shaped embryoid；I–L：Other type embryoids.

图2 青花菜小孢子培养配子体发育途径

A：四分体时期；B：单核早期；C：单核靠边期；D：双核期；E、F：花粉粒。

Fig. 2 Microspore gametophytic development of broccoli

A：Tetrad stage；B：Young microspore；C：Vacuolate microspore；D：Bicellular pollen；

E，F：Mature tricellular pollen.

孙继峰，方智远，袁素霞，李占省，杨丽梅，庄 木，张扬勇，孙培田，刘玉梅. 不同温度预处理对青花菜小孢子胚胎发生的影响.

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2.3 不同温度预处理对小孢子胚胎发生频率的影响

由表1可知，4 ℃的低温预处理1 d可以诱导小孢子的胚胎发生，但是频率很低，对于易出胚材料‘B908’的诱导率也仅为6.57，不易出胚的‘B1092’更低。32.5 ℃热激处理1 d使两个材料的小孢子出胚率显著提高，‘B908’的出胚率相对于4 ℃低温预处理提高了1.69倍，‘B1092’的出胚率提高了3.73倍。3个温度预处理中，4 ℃ 1 d → 32.5 ℃ 1 d的组合处理效果最好，‘B908’出胚率高达50.37，难出胚的‘B1092’的诱导效果更明显，高达70.40。

表1 不同温度预处理对青花菜游离小孢子出胚率

（平均单蕾出胚数）的影响

Table 1 Effect of different pre-treat temperatures on

microspore embryogenesis in broccoli

预处理 Pre-treatment

25 ℃（对照Control） 4 ℃1 d 32.5 ℃1 d

4 ℃1 d→32.5 ℃1 d

B908

0.87 ± 0.05 a 6.57 ± 0.59 b 11.13 ± 0.96 c 50.37 ± 3.79 d

B1092 0 a

0.33 ± 0.33 b 1.23 ± 0.50 c 70.40 ± 4.50 d

注：同一列数据后不同小写字母表示差异达到显著水平（P < 0.05）。 Note：Within the column，means followed by the same lowercase letter are not significantly different at the 0.05 level.

3 讨论

本试验通过荧光染色观察和普通光学显微观察比较了不同温度预处理条件下青花菜小孢子胚胎发生的途径。结果显示，不同温度预处理条件下，单核靠边期和双核早期的小孢子胚胎发生途径和发育类型基本相同，都是以B途径为主，在分裂前都出现了小孢子膨大，之后均等分裂产生二细胞体，最后经一系列分裂分化形成胚状体，也出现了小孢子膨大后的非均等分裂的发育途径。花粉发育是一个配子体发育途径的过程，单核小孢子分裂，形成1个大营养核和1个小的生殖核，生殖核继续分裂，并最终形成具有三核的成熟花粉粒。同时，在胚胎发生途径观察的过程中，发现一类特殊的细胞团和胚状体（图1，I ~ L），它们的特点是有具柄结构（长条形的细胞团）。在胚状体发生的5种途径中，E途径可能会产生具柄结构，因此推断青花菜小孢子发生过程中除了B途径为主要途径外，可能还有E途径。

在本研究的不同处理试验中均有小孢子的膨大和分裂，其中4 ℃低温预处理条件下的膨大和分裂细胞数最少，4 ℃→32.5 ℃组合处理条件下的膨大和分裂细胞数最多。从不同温度预处理条件下小孢子胚胎发生频率看出，32.5 ℃高温预处理比4 ℃低温预处理对小孢子胚胎发生的诱导效率高，两者在一定而4 ℃→32.5 ℃组合处理的诱导频率比单独的4 ℃低温或32.5 ℃高温诱导频率高很多，

程度上相吻合。本研究中，4 ℃低温处理比25 ℃对照试验更能促进细胞膨大和细胞分裂，进而促进了胚状体发生和提高出胚率，这与Touraev等（1997）和Pechan和Smykalp（2001）在甘蓝和油菜的研究结果相符合。这可能是4 ℃低温促进了小孢子分化，提高出胚率。本研究中，32.5 ℃高温对小孢子膨大和分裂的促进作用明显大于4 ℃低温和25 ℃常温，4 ℃→32.5 ℃高温组合处理对小孢子膨大和分裂的促进作用极显著大于4 ℃低温、25 ℃常温和32.5 ℃高温的单独处理。从出胚率来看，4 ℃→ 32.5 ℃高温组合处理的出胚率远远大于32.5 ℃高温和4 ℃低温的出胚率，比32.5 ℃高温和4 ℃低温的出胚率的和还要高，这说明，4 ℃低温和32.5 ℃高温所诱导小孢子胚胎发生的过程不是两个单独的过程，而是两个相互作用的过程，部分过程可能处于同一信号通路或者级联反应过程之中。为32.5 ℃高温预处理小孢前期的4 ℃低温预处理使得小孢子内部结构或理化性质发生了某些变化，

子胚胎发生提供了某些条件，使处理后的小孢子更容易吸水膨大并分裂。4 ℃ 1 d→32.5 ℃ 1 d组合处理对难出胚的‘B1092’的诱导效果比对‘B908’更明显，可能的原因是，在4 ℃低温预处理时不易出胚的‘B1092’比易出胚的‘B908’更容易产生某些中间物质，中间物质对32.5 ℃处理的