胶体金免疫层析法快速测定玉米和小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇

胶体金免疫层析法快速测定玉米和小麦

中脱氧雪腐镰刀菌烯醇

牟

钧，陈

昱，杨

军，李贵友

（四川省粮油中心监测站，四川成都610031）

要：采用高效液相色谱法对脱氧雪腐镰刀菌烯醇阳性样品进行定值，将阳性样品制备为不同毒

素含量的验证样品，对胶体金免疫层析法的准确性、重复性、稳定性、最低检出限、误差范围进行了验证试验，并且完成了对实际样品的检测，同时采用酶联免疫法（ELISA）进行对比，试验结果为：最摘

低检出限小麦800ng/g，玉米1000ng/g。检测结果与酶联免疫法一致，具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好、分析结果易于判定的特点，适用于样品的现场快速检测。关键词：胶体金免疫层析法；脱氧雪腐镰刀菌烯醇；玉米；小麦中图分类号：TS207．5

文献标识码：A

文章编号：1007－7561（2012）01－0034－02

由于真菌的寄生和真菌毒素的产生，严重影响农作物的产量，降低农产品和饲料品质，造成巨大经

全世界每年由于霉变污染真菌毒素引起的济损失，

农产品和工业原料的损失达数百亿美元。其中，脱

简称DON）是较氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，

为常见、影响较大的一种真菌毒素。DON主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，人和动物在误食被该

头痛、发热和恶毒素污染的粮谷类后常引起呕吐、

IgA肾病心。近年来发现DON可能与人类食管癌、［1］

对人类及动物的健康构成威胁。因此，各有关，

国都对谷物及饲料中DON的含量制定了严格的限量标准，我国谷物中DON的限量标准为1．0mg/kg［2］，监控DON的含量显得意义重大。粮食及饲料中真菌毒素的检测方法可以分为三类：一类是生物学检测法，包括种子发芽、呕吐试验等，很不利于快速检测，也很少利用；一类是理化检测，薄层色谱法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）。薄层色谱法（TLC）的灵敏度差，而高效液相色谱法（HPLC）的灵敏度高，但样品处理麻烦，操作复杂，仪器昂贵。另一类是免疫检测法，如酶联免疫法（ELISA）和胶体金免疫层析法。ELISA法适合大批

单个样品测试成本较高；胶体金免量样品集中检测，

疫层析法是以胶体金作为示踪物应用于抗原抗体反

应的一种新型免疫标记技术，是基于在NC膜上的抗原与抗体的反应。胶体金免疫快速检测法具有操作简单、快速、无需复杂仪器而只需眼睛观测、稳定

检测成本低和适合现场检测等特点，非常适性较好、

合单个样本的快速检测，目前已得到广泛应用。

收稿日期：2011－03－29作者简介：牟钧（1965－），女，重庆云阳人，高级工程师．

1

1．1

材料与方法

仪器与材料

酶联免疫检测仪，高效液相色谱仪（Agilent

1100），低速离心机，胶体金免疫层析法试剂盒（北京华安麦科生物技术有限公司），酶联免疫试剂盒（ELISA）（德国拜发），小型粉碎机，电子天平、移液枪等。1．21．2．1

方法

高效液相色谱法

免疫亲和层析净

仪器条件按照国家标准《GBT23503—2009食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定

［3］

化高效液相色谱法》要求。1．2．2

胶体金免疫层析法

1．2．2．1称取1．00g有代表性的粉碎的样品加入到离心管中，然后向离心管中加入6mL工作浓度样品稀释液，震荡提取5min，过滤或4000r/min离心1min，滤液或上清液即为检测液体。1．2．2．21．2．2．3

取上述检测液3滴滴入待测液于速测卡

5～10min判读检测结果。的检测区域内，

检测结果判读

T线显色，判为阴性；阴性：C线显色，

T线不显色，阳性：C线显色，判为阳性；无效：C线不显色，无论T线是否显色，判为无效。

1．2．3

酶联免疫法

实际样品的酶联免疫法检测是采用德国拜发的

方法为试剂盒提供的酶联免疫法定量检测试剂盒，

［3］

脱氧雪腐镰刀菌烯醇操作规程。

2．3

准确性

采用测试卡对已知真菌毒素含量的验证样品进行测定，对比检测的实际结果与该浓度的理论结果，判定检验结果的准确性。试验结果见表4，从表4可知：本方法的准确性与理论结果一致。

表4

样品种类

理论浓度/（ng/g）1145

玉米

标准偏差/（ng/g）75．827

小麦

100090080021321000800700

方法的准确性

结果阳性阳性阴性阴性阳性阳性阳性阴性

是否相符

是是是是是是是是

检验结果（双试验）12只出现C线只出现C线T线出现C、T线出现C、只出现C线

只出现C线只出现C线

T线出现C、

只出现C线

只出现C线T线出现C、T线出现C、只出现C线

只出现C线只出现C线

T线出现C、

2

2．1

结果与讨论

样品的定值

按照国家标准《GBT23503—2009食品中脱氧

雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和层析净化高效液

相色谱法》进行对脱氧雪腐镰刀菌烯醇阳性样品检测。定值单位为北京、湖北、重庆、广西、四川、辽宁等定值结果见表1。不同浓度阳性样省级粮油质检站，

品是通过阳性样品和空白样品按比例稀释而来，定值结果和不同浓度阳性样品的制备结果见表2。

表1

样品种类玉米小麦

阳性样品定值结果

平均值

/（ng/g）11452132

阳性样品的结果

/（ng/g）1280104821342095

1125116021402160

11301130

注：阳性样品的定值结果由国家粮油质检中心提供，并按数理统计对可疑值进行取舍。

表2

试样制备表

2．4

重复性

使用同一批次的测试卡分别对同一毒素含量的

考察同一批次的重复性。验证样品进行重复试验，

试验结果见表5，由表5可知，测试卡在不同的毒素

含量下的重复性好。

表5

样品种类

理论浓度/（ng/g）1145

玉米

10008001000

小麦

800700

方法的重复性检验结果（6次试验）

只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线T线出现C、T线出现C、T线出现C、

T线出现C、T线出现C、T线出现C、

只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线

T线出现C、T线出现C、T线出现C、

T线出现C、T线出现C、T线出现C、

结论阳性阳性阳性阳性阴性阴性阳性阳性阳性阳性阴性阴性

样品阳性样品的定值阳性样品的空白样品的制备样品

种类结果/（ng/g）质量/g质量/g理论值/（ng/g）

4．80

玉米

1145

4．373．933．492．582．34

小麦

2132

2．151．851．64

0．200．631．071．512．422．662．853．153．36

1100100090080011001000900800700

2．2最低检出限

按照在理论检出限的10%浓度梯度进行试验，

在某个浓度下为阳性，低10%的浓度下为阴性，该浓验证结果见表3，从表3可知：本度即为最低检出限，

方法的最低检出限小麦800ng/g，玉米1000ng/g。

表3

样品种类

理论浓度/（ng/g）1100

玉米

10009001000900

小麦

800700

最低检出限检验结果（6次试验）

只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线T线出现C、T线出现C、T线出现C、

T线出现C、T线出现C、T线出现C、

只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线

结论阳性阳性阳性阳性阴性阴性阳性阳性阳性阳性阳性阳性

2．5稳定性

使用厂家3个不同批次的测试卡分别对同一毒

考察不同批次的素含量的验证样品进行重复试验，

测试卡在三个不同的批稳定性。试验结果见表6，

次下的稳定性好。

表6

理论浓度测试卡的/（ng/g）产品批次

20101223

测试卡的稳定性检验结果（6次试验）

结论阳性阳性阳性阳性

1000

只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线只出现C线

20101123

只出现C线只出现C线只出现C线

只出现C线只出现C线只出现C线阳性

20101023只出现C线只出现C线只出现C线阳性

只出现C线只出现C线只出现C线阳性

T线出现C、T线出现C、T线阴性出现C、

T线出现C、T线出现C、T线阴性出现C、

（下转第54页）

仓储物流

水平。根据环比增长率预测，预计2020年江苏省粮食产量为3213万t。

2009年江苏省人口数达到7724．5万人，禽畜根据口粮和饲料粮推算的需产品产量折552万t，

求为2937万t，其中饲料玉米需求为704万t。根据2020年人口增长及人均口粮消费预测口粮消费、根据饲料工业增长预测浙江饲料用粮、其他需求按比例计算，综合预测2020年江苏粮食年消费其中饲料玉米缺口量约为875万量可达3150万t，t左右。

，江苏地处全国粮食产销“过渡带”又是国际粮“窗口”，食贸易的对接省际间和国际间粮食流通量较大，一部分是用于满足省内市场需求，一部分是加一部分满足省外的原粮需求，总体工和贸易的需要，

呈现大购大销、大流通、大市场的局面。江苏在粮食流通品种结构上比较复杂，主要粮食品种既有流入省内生产又有流出。口粮的主要品种小麦和稻谷，有节余，毗邻的上海、浙江等粮食主销区市场对这两尤其是粳稻依存度很大，形成外流；江苏粮个品种，

尤其面粉加工业发达，为了满足加食加工能力较强，

工业的需要，需省外采购或进口部分小麦，外销面油脂用粮的主要品种玉米、大豆，省粉。饲料用粮、

内产不足需，缺口量较大，主要依靠省外流入或进口

粮油食品科技第20卷2012年第1期

江苏主要流入玉米、大豆，部分流解决。概括来说，

入小麦、稻谷；主要流出小麦、稻谷。江苏玉米流入主要来自东北三省和山东、河北；大豆主要依靠进安徽、山东；稻谷流入来自安口；小麦流入来自河南、

徽和东北三省。江苏小麦、稻谷流向广东、浙江、上福建等主销区。另外，从江苏港口购进的进口大海、

江苏流入玉米488万t，豆约有700万t。2009年，

进口大豆706万t（其中200万t在舟山减载），流入小麦约50万t，稻谷约100万t；流出小麦500万t，稻谷490万t，成品粮和其他品种的原粮180万t。根据上述口粮和饲料用粮的预测，到2020年，江苏大豆进口需求900万t，预计玉米流入需求650万t，流出基本能够保持现状。

5长三角粮食流量预测

根据上述上海、浙江、江苏的粮食流量预测，到

2020年，长三角地区粮食流入量可达3930万t，其主要从东北地区流入，海运为主要中玉米1370万t，

运输方式，部分通过铁路运输。稻谷、小麦1210万t，东北地区的稻谷通过海运或铁路运入，其他为内河和公路运输，进口大豆1350万t；粮食流出量为1500万t，主要是稻谷、小麦及部分玉米、大豆和成

品粮。●

檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪（上接第35页）2．6

约定误差范围的验证

分别按照10%的误差进行试验，测定不同梯度

个阳性（大于检出限1000μg/kg）。由此可见：胶体金

免疫层析法与酶联免疫法的检测结果是一致的。

表8胶体金测试卡与酶联免疫法（ELISA）的结果比较

试验结果见表7，由表7可知：本次试验的验证样品，

在10%误差范围内的误判率为0%。

表7

样品种类小麦

800阴性阴性阴性阴性

玉米

阴性阴性

约定误差范围的验证

1200阳性阳性阳性阳性阳性阳性

0误判率/%0

10%浓度梯度/（ng/g）90010001100阴性阳性阳性阴性阴性阴性阴性阴性

阳性阳性阳性阳性阳性

阳性阳性阳性阳性阳性

参考文献：

［1］UenoY，IIjimaK，WangSD，etal．Fumonisinsasapossiblecomtribu-toryriskfactorforprimarylivercancer：a32yearstudyofcornharvest-China，byHPLCandELISA［J］．FoodandChemicaledinHaimen，

Toxicology，1997，（35）：1143－1150．

［2］袁宝君，S］．北郑云雁，谢华明，等．GB2715—2005粮食卫生标准［

2005．1．京．中国标准出版社，

［3］AbdeiLahZ．Reviewonthetoxicity，occurrence，metabolism，detoxifi-cation，regulationandintakeofzearalenone：Anoestrogenicmycotox-in［J］．FoodChemToxico，2007，（45）：1－48．

［4］张辉珍，王晓滨，单连菊，等．GB/T23503—2009食品中脱氧雪腐

镰刀菌烯醇的测定

．北免疫亲和层析净化高效液相色谱法［S］

2009．5．京．中国标准出版社，

［5］李端，李特．酶联免疫法定量检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇操作规程

注：误判率为出现误判的个数占总数的百分比。

2．7

与酶联免疫法（ELISA）的对比

本人选取了12种不同含量样品分别按（1．2．2胶

体金免疫层析法）和（1．2．3酶联免疫法）进行测定，测

ELISA的检测结果为定结果见表8，由表8可以看出，小于1000μg/kg有6个样品，胶体金免疫层析法的检

测结果为阴性（＜1000μg/kg）；ELISA的检测结果6个样品大于1000μg/kg，胶体金免疫层析法检出为6［Z］．拜发分析系统销售（北京）有限公司，2001．1．●