几丁质酶菌株L_012_的产酶条件研究

粮油食品科技第21卷2013年第4期

生物工程

几丁质酶菌株L012的产酶条件研究

谭海刚，李

静

(青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109)

摘

要：在前期实验的基础上，进一步对优良菌株L012的产酶条件进行了研究。结合单因素实验和

正交实验结果，确定了该菌株的最佳产酶培养基组成(g/L):细粉几丁质10，淀粉3，玉米浆3，NaNO31．0，K2HPO41．05，KH2PO40．45，NaCl0．1，MgSO4·7H2O0．3，FeSO4·7H2O0．03，pH7．0;最佳培养条件:起始pH7．0，培养温度30℃，摇瓶装液量30mL，摇床转速180r/min，接种菌龄24h，接种量10%，发酵时程48h。条件优化后，菌株L012产酶水平从原来的0．75IU/mL提高到2．31IU/mL。

关键词：几丁质酶;菌株L012;条件;优化中图分类号：TS201．3

文献标识码：A

文章编号：1007－7561（2013）04－0103－04

StudyonthechitinaseproductionfromstrainL012

TANHai－gang，LIJing

（CollegeofFoodScience＆Engineering，QingdaoAgriculturalUniversity，QingdaoShandong266109）Abstract：TheenzymeproductionconditionsofstrainL012werestudiedbasedontheformertest．Theopti-malconstituteoftheculturemediumforenzymeproductionwasascertainedbysinglefactorandorthogo-nalexperiments，whichwas（g/L）chitinpowder10，starch3，cornsteepliquor3，NaNO31．0，K2HPO41．05，KH2PO40．45，NaCl0．1，MgSO4·7H2O0．3，FeSO4·7H2O0．03，pH7．0．TheoptimalcultureconditionswereinitialpH7．0，temperature30℃，theliquidintheshakeflask30mL，shakerrotationalspeed180r/min，inoculumage24h，quantityofinoculation10%andfermentingtime48h．Theactivityofchitinasewasenhancedfrom0．75IU/mLto2．31IU/mLafteroptimizingtheconditions．Keywords：chitinase；strainL012；condition；optimization随着对微生物产几丁质酶研究的不断深入，几丁质酶在农业、工业、食品乃至药物中的应用必将发挥越来越重要的作用。国内几丁质酶的研究起步较晚，报道虽然多，然而几丁质酶的多样性导致了其调再加上从自然界中分离到的酶活控机理的复杂性，

性不是太高，以至于离工业应用还有较远的距离

［1］

提高其产酶活力。行了优化，

1

1．1

材料与方法

主要试剂

［3］

胶体几丁质：按SunChulKang方法制备；细

粉几丁质、壳寡糖：济南海得贝公司；其他试剂均为分析纯。1．2

培养基

液体种子培养基（g/L）：葡萄糖1．0，玉米浆5，NaNO31．0，K2HPO41．05，KH2PO40．45，淀粉3，NaCl0．1，MgSO4·7H2O0．5，FeSO4·7H2O0．03，pH7．0，121℃灭菌20min。

摇瓶发酵培养基（g/L）：细粉几丁质10，淀粉3，NaNO31．0，K2HPO41．05，KH2PO40．45，玉米浆3，NaCl0．1，MgSO4·7H2O0．3，FeSO4·7H2O0．03，pH7．0，121℃灭菌20min。

。

研究发现，微生物几丁质酶的产量与诱导物、碳pH、源、氮源、碳氮比、温度和溶解氧等许多因素有关

［2］

。本文在前期筛选产几丁质酶菌种的基础上，

选择菌株L012作为主要的研究对象，结合单因素实验和正交实验对该菌株的产酶培养基和培养条件进

收稿日期：2012－11－09

基金项目：山东省科技攻关计划项目（031010115）

1979年出生，作者简介：谭海刚，男，山东临朐人，硕士．1981年出生，通讯作者：李静，女，山东济南人，硕士．

生物工程

1．3

培养方法

30mL种子培养基装于250mL三角瓶中，接入1～2环斜面菌种，30℃、160r/min振荡培养24h，作为种子；250mL三角瓶中装入35mL发酵培养30℃、160r/min振荡基，按8%接种量（v/v）接种，过滤得粗酶液，测定酶活力。培养48h，1．4

产酶培养基及发酵条件的优化在前期实验结果基础上

［4］

粮油食品科技第21卷2013年第4期

确定了酶的诱导性后，选择胶体几丁质、细粉几壳寡糖（聚合度大于10）等不同结构类型的几丁质、

丁质作为诱导物，考查其对产酶的影响，结果见图2

。

进行单因素和正交

试验，优化确定最佳产酶培养基和产酶条件。

产酶条件优化思路如图1

。

图2各种诱导物对菌株L012产酶活力的影响

图2结果表明，胶体几丁质、细粉几丁质、壳寡糖对菌株L012产酶具有不同的诱导效果。诱导效果为壳寡糖﹥细粉几丁质﹥胶体几丁质。诱导物添加量达到10g/L时产酶达到最高，当继续加大诱导物的用量时酶活力变化不大。

以上结果表明，壳寡糖诱导效果最佳，细粉几丁质也有较好的诱导效果，从经济以及产业化应用角

图1

产酶条件优化方案

度考虑，确定选用细粉几丁质作为诱导物。2．1．2

正交试验确定最佳产酶培养基

固定培

养基中其他成分不变，以10g/L细粉几丁质为诱分别以不同种类、不同浓度碳源、氮源、无导物，

根据各成分对菌株L012产酶机盐进行摇瓶发酵，

水平的影响，初步确定的培养基组成成分情况见

微生物所

表2

［4］

1．5分析方法

5］；生物量测定：酶活力分析方法：参照文献［

［6］

菌体干重法。

2

2．1

结果与分析

培养基组成的确定

诱导物对菌株L012产酶的影响

2．1．1。

表2成分淀粉

各营养成分对菌株L012产酶的影响

浓度/（g/L）

3．010．05．02．00．51．05+0．45

0．03

酶活/（IU/mL）

0．990．681．010．830．900．980．88

产几丁质酶多数属于诱导酶。培养基中加入不同量几丁质时测定菌株L012的几丁质酶活力，结果见表1。

表1

诱导物

几丁质对菌株L012产酶的影响加量/（g/L）

05．0

几丁质

10．015．020．0

酶活力/（IU/mL）

0．00．680．950．940．94

细粉几丁质玉米浆NaNO37H2OMgSO4·K2HPO4+KH2PO4

FeSO4·7H2O

考虑到各因素之间的相互影响，最终培养基成

表1结果表明：当培养基中不添加几丁质发酵液中测不到酶活力，说明菌株L012所产几时，

丁质酶属于诱导酶，因此发酵培养基中必须添加几丁质。

分的确定需要对以上各因素进行综合考查。设计五因素四水平正交试验对培养基中的主要成分进行考察，实验设计及结果分析分别见表3和表4。

粮油食品科技第21卷2013年第4期

表3

实验因素水平表

因素

水平

A淀粉2468

B玉米浆1357

CNaNO3

1234

DMgSO40．10．30．50．7

E

K2HPO4+KH2PO4

0．35+0．150．7+0．31．05+0．451．4+0．6

g/L

生物工程

定为最优方案。结合前期单因素实验结果，确定最淀粉佳发酵培养基配方为（g/L）：细粉几丁质10，3，NaNO31．0，NaCl0．1，MgSO4·7H2O玉米浆3，0．3，FeSO4·7H2O0．03，pH7．0。2．22．2．1

培养条件对菌株L012产酶的影响接种菌龄的确定

选择不同生长期的液体

1234

30℃、180r/min摇瓶培养48h，种子接种发酵液，

测定发酵中几丁质酶活性，结果见图3

。

表4

序号12345678910111213141516K1K2K3K4k1k2k3k4R优方案

A11112222333344445．546．024．934．001．391．511．231．000．51A2

B12341234123412345．605．565．034．31．401．391．261．080．32B1

正交实验结果C12344321214334125．145．984．864．511．291．501．221．130．37C2

D12342143341243215．235．264．845．161．311．321．211．290．11D2

E12343412432121435．34．685．505．11．311．171．381．280．21E3

酶活力

/（IU/mL）1．581．611．321．031．601．571．751．101．491．450．951．040．930．931．011．13

图3

种龄对L012菌株产酶的影响

结果表明：接种菌龄为20～24h的种子液最有利于菌株产酶，因为这时菌株L012正生长于对数生长期中期，酶系丰富活跃，代谢旺盛，接种到子代培养时延滞期短，利于获得最大产酶量。2．2．2

正交实验确定菌株L012的最佳培养条件

［4］

在单因素实验结果基础上5，结果分析见表6。

，对影响菌株发酵

产酶的主要因素进行正交实验研究。实验设计见表

0．25，由表6算出5列的极差分别为0．05，0．11，0．10，0．19，极差顺序：B（pH）﹥E（接种量）﹥C（装液量）﹥D（转速）﹥A（温度）。结果显示：pH值和接种量是影响菌株产酶水平较大的因素，以后的实验中应特别注意，一般接种量大，延滞期短，反变化幅度比较平之则长；温度和溶氧量影响较小，

坦，表明该菌产酶对通风要求不是很严格，且温度适应范围较广。

表5

实验因素水平表

因素

水平

A

温度/℃25303540

BpH6789

C装液量/mL25303540

D转速/（r/min）140160180200

E接种量/（%，v/v）

36912

0．32，由表4算出5列的极差分别为0．51，0．37，0．11，0．21，极差顺序：A（淀粉）﹥C（NaNO3）﹥B（玉米浆）﹥E（MgSO4）﹥D（K2HPO4+KH2PO4），分析得出较优搭配方案：A2B1C2D2E3。此方案在已经做过的16组实验中没有出现，对其进行发酵产酶验证，测得酶活力为2．05IU/mL，比以上16组实验中最高酶活力高出0．4IU/mL，固可确

1234

注：装液量为每250mL三角瓶中的装量。

生物工程

表6

序号12345678910111213141516K1K2K3K4k1k2k3k4R优方案

11112222333344446．396．466．336．271．601．621．581．570．05A2A

12341234123412345．856．826．696．091．461．711．671．520．25B2B

12344321214334126．316．636．306．211．581．661．581．550．11C2

正交实验结果C

12342143341243216．296．326．56．131．571．581．631．530．1D3D

12343412432121436．136．016．576．741．531．501．641．690．19E4E

酶活力/（IU/mL）1．381．681．751．581．491．791．701．481．651．731．521．431．331．621．721．60

图4

粮油食品科技第21卷2013年第4期

菌株L012在条件优化前后生物量及产酶活力比较

结果表明，菌株L012在条件优化前后的生长曲线变化趋势基本一致，不过生物量有明显增加；产酶水平由原来的0．75IU/mL升高到2．31IU/mL。

通过产酶条件优化实验，将酶活力提高了3倍。

3结论

（1）通过对培养基组分进行单因素实验和正交

确定了菌株L012的最佳产酶培养基（g/实验分析，

L）：细粉几丁质10，NaNO31．0，淀粉3，玉米浆3，K2HPO41．05，KH2PO40．45，NaCl0．1，MgSO4·7H2O0．3，FeSO4·7H2O0．03，pH7．0。

（2）通过对发酵起始pH值、生长温度、溶氧量、种龄、接种量及发酵时程等培养条件的考查，确定了菌株L012的最佳发酵产酶条件：起始pH7．0，培养温度30℃，摇瓶装液量30mL，摇床转接种菌龄24h，接种量10%，发酵速180r/min，时间48h。

（3）比较菌株L012在条件优化前后生长及产酶情况，条件优化后菌株产酶水平从原来的0．75IU/mL提高到2．31IU/mL。参考文献：

［1］．安徽熊国如，杨本鹏，王俊刚，等．微生物几丁质酶研究进展［J］

2010，38（22）：11685－11688．农业科学，

［2］D］．山东轻工业学院，2006．李静．产几丁质酶微生物的筛选［［3］万云洋，杜予明，杨建红，等．甲壳酶特性与应用研究［J］．天然产

2003，15（6）：572－579．物研究与开发，

［4］李静，刘建军，赵祥颖．一株产几丁质酶微生物的筛选及其产酶

J］．工业微生物，2007，37（3）：44－47．条件的研究［

［5］IMOTOT，YANAGISHITAK．Asimpleactivitymeasurementoflyso-zyme［J］．AgrBiolChem，1971，（35）：1154－1156．

［6］．北京：高等教育出版社，周德庆．微生物学教程（第三版）［M］

由表6分析得出较优搭配方案：A2B2C2D3E4。此方案在已经做过的16组实验中没有出现，对其进行发酵产酶验证，测得酶活力为2．31IU/mL，比以上16组实验中最高酶活力高出0．52IU/mL，可确定为最优方案。结合前期单因素实验结果，确定最培养温度30℃，摇瓶佳培养条件为：起始pH7．0，

装液量30mL，摇床转速180r/min，接种种龄24h，接种量12%，发酵时程48h。2．3

菌株L012条件优化后产酶能力的变化采用优化前、后两种摇瓶发酵培养基和培养条件，接种种龄24h左右的液体种子进行摇瓶发酵实验，产酶菌株L012菌体生长及产酶进程曲线如图4所示

。

2011：151－153．●