醋化醋杆菌产乙醇脱氢酶发酵培养基的优化

醋化醋杆菌产乙醇脱氢酶发酵培养基的优化

王

陶，李

文，陈亚庆

(徐州工程学院江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏徐州221008)摘

要：采用单因素及正交试验对醋化醋杆菌产乙醇脱氢酶的发酵培养基进行优化，以期提高菌株

MgSO4产乙醇脱氢酶的水平。结果表明，培养基最优配方为:葡萄糖1%，酵母浸膏2%，乙醇3%，

0．05%，KH2PO40．45%。在此优化条件下，菌株培养3d产酶达到最大，为0．423U/mL。

关键词：正交;优化;醋化醋杆菌;乙醇脱氢酶;培养基中图分类号：Q93－335

文献标识码：A

文章编号：1007－7561（2014）01－0104－05

Optimizationoffermentationmediumforalcoholdehydrogenasefromacetobacteraceti

WANGTao，LIWen，CHENYa－qing（KeyLaboratoryofFoodＲesourcedevelopmentand

QualitySafetyofJiangsuProvince，XuzhouInstituteofTechnology，XuzhouJiangsu221008）Abstract：Thefermentationmediumofalcoholdehydrogenaseproducedfromacetobacteracetiwasopti-mizedbysinglefactorexperimentsandorthogonalexperimentstoincreasethestrains’activityofprodu-cingalcoholdehydrogenase．Theresultsshowedthattheoptimalformulawasglucose1%，yeastextract2%，ethanol3%，MgSO40．05%，KH2PO40．45%．Undertheabovecondition，theenzymeactivitywas0．423U/mLafterfermentationfor3days．

Keywords：orthogonal；optimization；acetobacteraceti；alcoholdehydrogenase；culturemediumADH）是一乙醇脱氢酶（Alcoholdehydrogenase，

类分布广泛的含锌金属酶，属氧化还原酶第一亚类，

+

NADP+或PQQ作用于－CHOH基团，能以NAD、

具有广阔的市场前景

［10－14］

。醋化醋杆菌的细胞膜

中存在乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶，在醋酸发酵中，菌体即通过能够将乙醇氧化为乙醛的乙醇脱氢酶和将乙醛再氧化成醋酸的乙醛脱氢酶实现食醋酿造

［15］

为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应，为胞内酶

［1－3］

。

。在哺乳动物体内ADH和ALDH（乙醛脱氢

通过优化醋化醋杆菌发酵培养基可有效提高ADH产量，目前尚未见利用正交试验优化醋化醋杆菌产酶培养基的相关报道。本研究以徐州恒顺万通食品酿造有限公司醋醅中分离筛选得到的醋化醋杆菌为对象，采用单因素实验和正交试验优化其产酶培养基，使其产酶量提高，为拓宽ADH的来源、降低ADH的生产成本提供新的途径。

酶）构成了乙醇代谢的主要氧化通道，是体内乙醇代谢的主要限速因素。前者使乙醇转化为乙醛，后者使乙醛进一步转化为乙酸

［4－8］

。由此可见，ADH。

是乙醇在人体内代谢的必需酶，在解酒及防止乙醇引起的肝损伤方面具有重要意义

［9］

ADH已广泛应用于化工、医药、食品等工业领域，目前商品ADH多来源于动物肝脏，提取纯化工艺比较成熟，但其资源有限且价格昂贵，远远不能满足市场的需要，而微生物发酵的生产周期较短，培养基价格低廉，酶制剂可以实现大规模、低成本工业化生产，因此从微生物细胞中提取ADH并制成酶制剂

收稿日期：2013－07－09

基金项目：国家自然科学基金（81273004）；江苏省高校自然科学研究

面上项目（10KJD180006）；徐州工程学院科研基金培育课题（XKY2010112）；徐州工程学院科研基金青年课题（XKY2012313）：1976年出生，作者简介王陶，男，副教授．

1

1．1

材料与方法

菌种

高产醋化醋杆菌（Acetobacteraceti），分离自徐

州恒顺万通食品酿造有限公司的醋醅。1．21．2．1

培养基

斜面保藏培养基

pH4．5，葡萄糖1%，酵母膏1%，琼脂2%，CaCO31%，121℃灭菌20min，待其冷却后加入

胨、硝酸铵、硫酸铵对发酵产ADH酶活以及生物量的影响，确定最适氮源。1．6．4

氮源浓度的优化

2%、3%、选取最适氮源，考察其浓度（1%、4%、5%）对ADH酶活以及生物量的影响，确定最适氮源浓度。1．6．5

乙醇浓度的优化

3%、4%、5%、6%）对ADH考察乙醇浓度（2%、

酶活以及生物量的影响，确定最适乙醇浓度。1．6．6

KH2PO4浓度的优化

考察KH2PO4浓度（0%、0．15%、0．3%、0．45%、0．6%）对ADH酶活以及生物量的影响，确定最适KH2PO4浓度。1．6．7

［16］

3%（v/v）无水乙醇。1．2．21．2．31．31．3．1

种子液培养基发酵产酶培养基培养条件种子培养

接种试管中生长良好的菌株两环到装有100mL种子液的250mL锥形瓶中，摇瓶培养1d（32℃，120r/min）。1．3．2

发酵培养

向装有50mL发酵培养基的250mL锥形瓶中120加入10%的种子液，液体摇瓶培养3d（32℃，r/min）。1．4

乙醇脱氢酶酶活的测定乙醇脱氢酶活性的测定参照文献

的方法进行。

取25mL比色管，向其中加入0．5mLpH4．0的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，加10%曲拉通X－100溶液0．1mL，再加1．0mol/L乙醇溶液0．1mL，0．1mol/L铁氰化钾溶液0．1mL，发酵液0．2mL，放入25℃水浴锅中保温5min，然后加入硫酸铁－Du-panol溶液0．5mL，加入3．5mL蒸馏水混合后，在25℃条件下放置20min，同时做空白对照，并在12000（r/min）下离心5min，测定660nm处光密度。

酶活力单位定义：在上述OD值条件下，每分钟氧化1μmol乙醇为一个活力单位（4．0光密度等于氧化1μmol的乙醇）。1．5

生物量的测定

取发酵液，测定600nm处的光密度值（OD600），以空白培养基为对照。1．61．6．1

产酶培养基的优化碳源种类的优化

淀粉、麦芽糖、乳考察浓度都为1%的葡萄糖、

糖、蔗糖对发酵产ADH酶活和生物量的影响，确定最适碳源。1．6．2

碳源浓度的优化

pH4．5。葡萄糖1%，酵母膏1%，无水乙醇3%，pH6．0。葡萄糖1%，酵母膏1%，无水乙醇4%，

MgSO4浓度的优化

0．05%、0．1%、0．15%、考察MgSO4浓度（0%、

0．3%）对ADH酶活以及生物量的影响，确定最适MgSO4浓度。1．6．8

正交试验

对培养基中碳源浓度、氮源浓度、乙醇浓度、MgSO4浓度4个因素按照L9（34）正交表进行正交以确定产酶培养基的最优配方。试验设试验设计，计见表1。

表1

正交试验因素水平表

因素

水平

ABC

葡萄糖/%酵母浸膏/%无水乙醇/%

123

123

345

DMgSO4/%0．050．100．15

123

2

2．1

结果与分析

单因素实验碳源种类的优化

用浓度皆为1%的不同碳源培养菌体3d后测

2．1．1

定生物量和乙醇脱氢酶酶活，结果见表2。

表2

碳源葡萄糖麦芽糖淀粉蔗糖乳糖

不同碳源对菌体生长和产酶的影响

OD6000．868±0．0380．760±0．0790．704±0．0610．625±0．0160．753±0．086

酶活/（U/mL）0．259±0．0270．244±0．0150．127±0．0190．176±0．0230．179±0．005

1%、2%、选取最适碳源，考察其浓度（0．5%、3%、4%）对ADH酶活以及生物量的影响，确定最适碳源浓度。1．6．3

氮源种类的优化

考察浓度都为1%的酵母浸膏、牛肉膏、蛋白

生物工程

由表2可知，碳源对菌体的生长和产酶均有一定的影响，碳源为葡萄糖时，菌体的生物量和ADH的酶活均较高，因此，确定葡萄糖为最适碳源。2．1．2

碳源浓度的优化

表3

葡萄糖浓度/%

0．51234

葡萄糖浓度对菌体生长和产酶的影响

OD6000．759±0．0320．926±0．0240．878±0．0450．863±0．0630．836±0．033

酶活/（U/mL）0．120±0．0270．252±0．0340．235±0．0240．179±0．0290．127±0．017

粮油食品科技第22卷2014年第1期

产酶的下降期。因此，选择酵母浸膏浓度为2%。

表5

酵母浸膏浓度/%

12345

氮源浓度对菌体生长和产酶的影响

OD6000．792±0．0381．086±0．0381．265±0．0191．328±0．0431．395±0．044

酶活/（U/mL）0．217±0．0250．272±0．0080．126±0．0070．058±0．0130．050±0．014

2．1．5乙醇浓度的优化

菌体在不同乙醇浓度培养基中培养3d后测定乙醇脱氢酶酶活及生物量，结果见表6。从表6可以看出，随着乙醇浓度的上升，醋酸菌生物量增大，乙醇浓度4%时，醋酸菌生长最为旺盛，浓度继续增高，醋酸菌生长变缓；相应的乙醇脱氢酶活在乙醇浓度为4%时达到峰值，浓度继续增高，酶活迅速降低。可能是因为高浓度的乙醇对菌体细胞产生毒害作用，抑制了菌体的生长和产酶，所以最适乙醇浓度为4%。

表6

乙醇浓度/%

23456

乙醇浓度对菌体生长和产酶的影响

OD6000．588±0．0570．579±0．0480．690±0．0600．683±0．0500．646±0．084

酶活/（U/mL）0．174±0．0160．190±0．0140．221±0．0200．207±0．0120．166±0．005

在发酵培养基中添加不同浓度的葡萄糖，考察其对菌体生长和产酶的影响，结果见表3。由表3可以看出，当碳源浓度为1%时，乙醇脱氢酶酶活最高，此时生物量也最高。随着碳源浓度的不断上升，菌体的生长反而受到一定的抑制，酶活也随之降低。所以最佳碳源浓度为1%。2．1．3

氮源种类的优化

在发酵培养基中添加浓度分别为1%的酵母浸膏、牛肉膏、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵，其对乙醇脱氢酶酶活及生物量的影响见表4。由表4可以看出，添加有机氮源时的ADH酶活普遍高于无机氮源，对应的生物量也较大。可能是有机氮源可以为菌体提供更多的营养，因此菌体生长较好，相应酶活也较大。当氮源为酵母浸膏时，菌株的生长和乙醇脱氢酶酶活最高，因此，选用酵母浸膏作为最适氮源。

表4

氮源酵母浸膏牛肉膏蛋白胨硝酸铵硫酸铵

氮源种类对菌体生长和产酶的影响

OD6000．741±0．0720．581±0．0300．354±0．0270．199±0．0710．051±0．010

酶活/（U/mL）0．259±0．0060．256±0．0440．106±0．0080．014±0．0090．013±0．003

2．1．6

KH2PO4浓度的优化

在微生物的生长繁殖和合成目的产物的过程中，常需要某些无机盐和微量元素作为生理活性物质的组成或生理活性物质合成时的调节物。K能同时也是参与细胞内许多物质的运输系统的组成，多种酶的激活剂

［16］

+

。在培养基中添加不同浓度的

KH2PO4，其对菌体生长和产酶的影响如表7所示。

表7

KH2PO4浓度/%

0．000．150．300．450．60

KH2PO4浓度对菌体生长和产酶的影响

OD6000．658±0．0630．686±0．0690．633±0．0270．672±0．0610．665±0．034

酶活/（U/mL）0．215±0．0140．206±0．0180．223±0．0120．254±0．0300．210±0．013

2．1．4氮源浓度优化

在糖浓度为1%的基础上，分别添加不同浓度的酵母浸膏进行发酵，结果如表5所示。由表5可以看出，随着氮源浓度的增大，菌体的生物量增大，但ADH酶活在酵母浸膏浓度为2%时最大，之后便逐渐降低，可能是因为氮源浓度过高，导致不适的碳氮比，使菌体生长速度过快，生长快的菌体较早进入

粮油食品科技第22卷2014年第1期

生物工程

表9

试验号1234

A1112223330．3450．3190．2410．104

B1231231230．2750．3800．2500．130

正交试验结果与分析

C1232313120．3440．2940．2660．078

D1233122310．3530．2640．2880．089

酶活/（U/mL）

0．4120．3780．2440．2710．4130．2720．1410．3490．234

由表7可以看出，在实验的浓度范围内，KH2PO4对菌体生长和产酶的影响较前面单因素的影响小些，添加较低浓度的KH2PO4促进了菌体的生长和产酶，但当浓度继续增大，生物量和酶活都有ADH酶活所降低。当KH2PO4浓度为0．45%时，最大。2．1．7

MgSO4浓度的优化

2+

微生物的生长需要一定数量的Mg，Mg2+在

56789均值1均值2均值3极值Ｒ因素主次最优方案

细胞膜的稳定性上微生物某些细胞结构如核糖体、

起重要作用，同时对微生物细胞中的酶有激活作用

［16］

。MgSO4的添加量对菌体生长和产酶的影响

如表8所示。

由表8可知，MgSO4浓度在0%到0．1%之间时，醋酸菌生长旺盛，同时，乙醇脱氢酶酶活也逐渐上升，当MgSO4浓度为0．1%时，醋酸菌生长最旺，乙醇脱氢酶酶活也达到峰值，当MgSO4浓度继续升MgSO4最适高，乙醇脱氢酶酶活呈下降趋势，因此，浓度为0．1%。

表8

MgSO4浓度/%

0．000．050．100．150．30

MgSO4浓度对菌体生长和产酶的影响

OD6000．644±0．0620．706±0．0090．706±0．0210．635±0．0230．722±0．009

酶活/（U/mL）0．205±0．0160．258±0．0200．341±0．0140．201±0．0550．180±0．023

B＞A＞D＞CA1B2C1D1

2．2．2验证试验

按照正交试验优选工艺A1B2C1D1和试验设计进行验证试验，中的最优组合A2B2C3D1，结果见表10。A1B2C1D1的酶活为0．422U/mL，高于A2B2C3D1的0．401U/mL。在α=0．05水平，两种条件下ADH酶活有显著性差异。实验结果表明，正交试验的最优条件是可行的。因此，醋化醋杆菌发酵产乙醇脱氢酶的最优培养基配方为：葡萄糖1%，酵母MgSO40．05%，KH2PO40．45%。膏2%，乙醇3%，

表10

试验12

葡萄糖/

%12

正交试验验证结果

MgSO4/%0．050．05

酶活/（U/mL）0．4220．401

2．22．2．1

培养基配方的正交优化正交试验

依据单因素实验结果，选择对菌体生长和产

酶影响较大的4个因素（即：葡萄糖浓度、酵母浸MgSO4浓度），进行4因素膏浓度、无水乙醇浓度、3水平的正交试验L9（34），正交试验结果见表9。由表9可以看出，根据Ｒ值的大小判断各因素对乙醇脱氢酶活的影响顺序是：因素B（酵母浸膏）＞因素A（葡萄糖）＞因素D（MgSO4）＞因素C（无水乙4因素的最佳组合醇）。比较均值的大小可以看出，

即葡萄糖1%，为：A1B2C1D1，酵母浸膏2%，乙醇3%，MgSO40．05%。而试验设计中的最优组合为A2B2C3D1，酵母浸膏2%，乙醇5%，即葡萄糖2%，MgSO40．05%。因此，需要设计验证试验来确定最优因素组合。

2．3

酵母浸膏/无水乙醇/

%%

22

35

最优条件下的产酶曲线

按照10%的接种量接入将发酵1d的种子液，

到50mL最优配方的发酵培养基中，30℃摇床培2d、3d、4d、5d、6d后测定乙醇脱养，分别在1d、氢酶酶活，结果见图1。由图1可以看出，随着发酵时间的延长，乙醇脱氢酶的酶活先上升，到第3d时，乙醇脱氢酶酶活最高，之后酶活开始逐渐下降，

生物工程

可能是随着发酵时间的延长，菌体衰亡，酶失活所致。因此，菌株发酵3d后就能获得酶活最高的乙醇脱氢酶，此时酶活达0．423U/mL，比优化前酶活提高了63．32%

。

粮油食品科技第22卷2014年第1期

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图1

产酶曲线

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［16］WILLISAW．MethodsinEnzymology［M］．SaltLakeCity：Aca-

3结论

可缩短生产利用微生物发酵生产乙醇脱氢酶，

周期，降低生产成本，通过对菌株的培养基进行优化，可进一步提高产酶水平。本研究选用醋化醋杆菌为乙醇脱氢酶生产菌株，通过单因素和正交试验优化其培养基配方，确定酶活最高时的培养基配方MgSO4为：葡萄糖1%，酵母浸膏2%，乙醇3%，0．05%，KH2PO40．45%。在该优化条件下，菌株培养3d产酶达到最大，为0．423U/mL，比优化前酶活提高了63．32%。正交试验与单因素实验的结果并不完全一致，这可能是考察的多因素之间的交互作用造成的。参考文献：

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