鸡传染性支气管炎病毒腺胃分离株的分子鉴定

中国农业科学+**(，（)*）：(L)++/a)((+0<&6$:&7FWI&<8H:8I7

0&$&<7

鸡传染性支气管炎病毒腺胃分离株的分子鉴定

程丽琴，周继勇，!"#$%&’’&，沈行燕，陈吉刚，张德勇

（浙江大学动物预防医学研究所，杭州

()**+,）

摘要：从发病鸡场中收集的腺胃肿大病料（编号为+-,.、，经匀浆和无菌处理后在012鸡胚中传(-,.和)-,/）代、分离和鉴定。结果显示，接种病料培养的鸡胚可干扰新城疫病毒的复制；这些分离毒株可与阳性标准参考株但表现出较低的中和反应能力。在理化和血凝特性等鉴定的基础上，参照已发表的345467896::6345抗血清反应，

毒株!"基因序列，设计并合成)对含有;<"=3和47>?3酶切位点的特异性引物，利用=@A1B=技术扩增到分离毒株(-,.、并将其<%EF片段插入到克隆载体G4H860<I&G:A0J（K）中，进行核苷+-,.、)-,/长度为)C,(’D的<%EF片段，酸序列的测定，确证所扩增和克隆的<%EF片段由),(*个碱基组成，并编码)条由L+*个氨基酸组成的多肽。与发现(-,.、M6$47$’中其它345!"基因序列进行比较，+-,.和)-,/毒株与所比较的345毒株核苷酸的一致性为氨基酸的一致性为./CPNO,,C.N。.(CLNO,,C.N，

关键词：鸡；传染性支气管炎病毒；=@A1B=；!"基因；克隆

!"#$%&#’()*’(’%+$(,-+,%-".!!/$0$".10.$%+,"&-2("0%*,+,-3,(&-1-"#’+$4.("5)*,%6$07("8$0+(,%&#&-B?;EMQ&AR&$，S?TU!&AV"$W，!"#$%&’’&，0?;EX&$WAV7$，B?;E!&AW7$W，S?FEM%6AV"$W

（#$%&’&(&)*+,-).)$&’.)/)&)-’$0-12)3’4’$)，56)7’0$89$’.)-%’&1，:0$8;6*(<"==>?）

9:-+(’%+：0Y"HH6$GI"Z6$:I&<8H&Y6I6<"HH6<:69，#">"W6$&[697$9G8I&\&69C08]G6<:69Z&I8]]7>GH6Y7]797G:69&$012<#&<’6$6>DIV"]\"IZ&I7H&]"H7:&"$7$9&96$:&\&<7:&"$C@#6Z&I8]#79]6Z6I7HD&"H"W&<7H<#7I7<:6I&]:&<]]&>&H7I:"345DV7WWH8:&$7:&$WI69DH""9<6HH]7\:6I:I67:>6$:Y&:#:IVG]&$C3:7H]"&$:6I\6I69Y&:#:#6I6GI"98<:&"$"\E6Y<7]:H69&]67]6Z&I8]&$<#&<’6$6>DIV"]C5&I8]&]"H7:6]7H]"6^#&D&:69H"Y6I]G6<&\&<$68:I7H&[&$WI67<:&"$Y&:#I6\6I6$<6G"]&:&Z63457$A

:&]6I8>C@#6G#V]&"<#6>&<7HGI"G6I:&6]Y6I67H]"96:6<:69&$:#&]I6]67I<#CT$:#6":#6I#7$9，GI"Z6$:I&<8H8]AG7:#"W6$&<3$\6<:&"8]4I"$<#&:&]5&I8](-,.，+-,.，)-,/=EF]6^:I7<:69\I">:#67HH7$:"&<\H8&9"\&$"<8H7:696>DIV"$7:696WW]Y7]<"$Z6I:69:"<%EFDVI6Z6I]6:I7$]<I&G:&"$Y&:#(_AGI&>6ICF>GH&\&69GI"98<:"\)C,(’DY7]]8D‘6<:69:";<"=37$947>?39&W6]:&"$7$9:#6\I7W>6$:]"D:7&$69Y6I6:#6]7>67]6^G6<:69C1"HV>6I7]6<#7&$I67<:&"$Y7]G6I\"I>69Y&:#

（K）Z6<:"I，7$9&:]$8<H6":&96]6A:Y"GI&>6I]Y#&<#]G7$:#6!"W6$6C@#61B=GI"98<:Y7]H&W7:69:"G4H860<I&G:A0J

R86$<6Y7]96:6I>&$69DV:#69&96"^VA>69&7:69<#7&$:6I>&$7:&"$>6:#"9CF<">G7I&]"$"\:#6$8<H6":&96]6R86$<6Y&:#:#7:"\":#6I345]:I7&$]&$M6$47$’]#"Y69:#7::#6#">"H"WVY7]D6:Y66$.(CLNa,,C.NC@#6#">"H"WV"\FFY7]D6:Y66$./CPNO,,C.NC

;$<="(4-：B#&<’6$；3$\6<:&"8]4I"$<#&:&]5&I8]；=@A1B=；!"W6$6；BH"$&$W

禽传染性支气管炎病毒（345）属于冠状病毒科套式病毒目冠状病毒属，其基因组是由大约+.CL’D的线状单链正股=EF组成，编码纤突蛋白（0）、膜蛋

白（d）和核衣壳蛋白（E）(种主要结构蛋白，其中0

糖蛋白又由0)和0+糖基化多肽组成。0)是通过是形成0球状末突起的主要部0+而连接到膜上的，

收稿日期：+**)A)*A)b

基金项目：国家自然科学基金资助项目（(,,.**(*）、浙江省自然科学基金资助项目（(,,P))）和浙江省重点科研资助项目（,,))*+*(*）

作者简介：程丽琴（),.+A），女，山西太谷人，博士研究生，主要从事动物病毒在转基因植物中表达方面的研究。周继勇为通讯作者，@6H-27^：

*b.)A/L,.)L,/；;A>7&H：‘V[#"8c[‘8C698C<$

$6期程丽琴等：鸡传染性支气管炎病毒腺胃分离株的分子鉴定$++)

分，是宿主的主要保护性抗原，也是!"#中和抗体和

［$%&］

血凝抑制抗体结合部位。从分子水平上研究对!"#基因!"基因的结构和分析其序列的同源性，

分型和免疫防治有良好的指导作用。近年来，国内许多学者发现一种以鸡腺胃肿大为致病特征的疾

［’%(］病，经分离鉴定病原，并从蛋白质、核酸角度分

!*"*#病毒血清交叉中和试验分别测定!"#5

78+、721:4、!"#5+,)-、&,)-、$,)(和.毒株的OZ/86 以每一病毒株$666L1Q$。固定病毒稀释血清，

OZ/86分别与不同稀释度的各毒株的阳性血清在按&-_中和反应$S。尿囊腔接种$6日龄鸡胚，

［$6］

报道的方法计算抗原相关值-。?H0[^22R

!*"*$分离毒株的血凝特性测定取第$6代感染

鸡胚尿囊液&666C,LD3离心&6LD3，上清液中加入终浓度为$a的胰蛋白酶，用$a的鸡&-_处理&S，

析了从腺胃分离的传染性支气管炎病毒（!"#）毒株

［)%$$］

与其它!"#的差异。为进一步分析腺胃分离的!"#毒株的特征，笔者将收集的腺胃病料进行了

病毒分离和!"基因克隆。

!

材料与方法

!*!

材料

!*!*!病料来源于不同地区鸡场采集病死鸡肿大的腺胃组织，分别编号为+,)-、&,)-和$,)(毒株；参考毒株为新城疫病毒（./#）012345&6毒株、!"#578+（9’$型疫苗标准株）、721:4

（肾型!"#毒株）和.

［$+］

毒株（浙江省分离并鉴定的肾型!"#毒株）均由本实验室保存；;<=种蛋购自山东家禽研究所;<=鸡实验场；;<=鸡!"#578+、721:4、>?)-$和.株以及

分离毒株+,)-、&,)-和$,)(阳性血清自制。

!*!*"大肠杆菌（#$%&’(%&()%*+(，#,%*+(*）/78!、@"1A4B0CD@:;E（F）由本实验室保存；GHI@1AB/.J<21KL4CHB4、

鼠源反转录酶（92123K59A1M5N.HB4）、限制性内切酶O02N（!$6P "1Q$）、"HL7（!$6P "

1Q$）、G’5/.J连接酶均购自9"!公司；=DCB:;:CH3R/.J;K3:S4BDBED:、P.!T58柱式/.J胶回收ED:、P.!T5$6柱式小量抽提ED:均购自上海;J.UV.生工生物公司；GN!W21C4HX43:购自U"!YV"NZ公司；T!JIAD0[<YN<ACD\D0H:D23ED:购自德国T!JUO.公司。!*"

方法

!*"*!野毒株的分离与传代将病死鸡腺胃组织按$]&（^]M）加入灭菌生理盐水制成匀浆，反复冻融&次；’_，$6666C,LD3离心$8LD3、取上清液过滤除菌，按$666!P L1Q$加入青霉素和链霉素。经尿囊腔接种$6日龄鸡胚，&-_继续孵化，每天照胚+次，剔除+’S死亡鸡胚，记录鸡胚死亡情况和胚体病变，收集死亡鸡胚尿液连续传代。!*"*"分离毒株对新城疫病毒的干扰试验按文献［’］的方法，将!"#5+,)-、&,)-、$,)(第$6代感染鸡胚尿囊液接种$6日龄鸡胚尿囊腔（6*+L1 枚Q$），&-_孵化$6S后再接种新城疫病毒012345&6毒株（每枚6*+L1），接种后继续孵化&‘S，收获鸡胚尿囊液，测定./#的血凝效价。

红细胞进行7J试验［’］

。!*"*%病毒N.J的抽提将无菌收集的感染鸡胚尿囊液融化，’_，$$666C,LD3，离心+6LD3，上清液转移入透析袋，加入蔗糖于’_浓缩病毒约+6%‘6倍，Q’6_备用。取浓缩后的病毒悬浮液(6"1，加入$L1GN!W21N4X43:试剂，按照说明书抽提N.J，进入反转录体系。

!*"*&NG5<YN参照已发表的!"#5"4HAR4::4株序列［$+］，设计$对特异性引物，为了便于克隆，分别加入O02N!和"HL7!酶切位点。+段引物的序列分别为：<CDL4C;$VZ!UV8b：8b5UUJJGGYUJJJJYG5UJJYJJJJUJYJUJY5&b；<CDL4C;$VZ!UV&b：8b5YUUUJGYYJUJUJJYGUYYJYJJJYJG5&b。按反转录试剂盒要求合成0/.J第一链，取$6"1!"#5N.J，+"1下游引物，-6_变性$6LD3，迅速置冰上，稍离心，依次加入$6cdA\\4C’"1，N.HB4抑制剂$"1，$6LL21 ZQ$R.G<+"1，’+_温浴+LD3，快速加入959A1M5N.HB4，继续反应86%-6LD3，-6_水浴$6LD3以灭活反转录酶。取反转录产物0/.J+"1，$6c<YNdA\\4C8"1，$6LL21 ZQ$R.G<，+段引物各$"1，混匀，)8_反应8LD3，置冰上，

加入GHI@1AB/.J聚合酶（8P "

1Q$）6*8"1，混匀，加灭菌水到总体积861，覆盖86"1石蜡油，进入以下程序：)’_’8B，88_’8B，-+_+LD3，循环&6次后，-+_延伸$6LD3。<YN产物用$a的琼脂糖凝胶电泳检测。!*"*’<YN产物的克隆和序列分析用T!JIAD0[@ACD\D0H:D23ED:纯化<YN产物。纯化产物与克隆载体@"1A4;0CD@:;E（F）进行O02N!,"HL7!双酶切，割胶纯化，/.J胶回收ED:抽提，在G’5/.J连接酶作用下，$‘_连接过夜，连接产物转化感受态/78!，涂于含氨苄青霉素、e5XH1和!<GU的平板上，培养$‘%+6S，

挑选白色菌落，少量制备质粒/.J，用$a的凝胶电泳，

初步确认为重组质粒后，进一步用<YN和O02N!,"HL7!酶切鉴定。经酶切和<YN鉴

定后的阳性克隆送去上海申友生物公司测序，为了

"

?!=B

中国农业科学

分离病毒胰酶处理血凝特性

=D卷

保证测序的正确性，选择!个克隆进行测序，测序反应重复!次。应用"#$%&’%(%)%*+%(,%-(#./$0$)12345#&%21&6#%0(31$7#(890(815$（:;-$3#&，90$,1($0(<=>?<）和@A’%(%等软件进行分析。

表!

P#Q.%!O%U#’’.+30(#301(1237%R0&+$0$1.#3%$3&%#3%850373&/V$0(

血凝效价

O-303&%

!?B!>!D

AW

!B

!??!E!>!B

!E!E!>!B

!H!??!>!B

!H!E!E!B

!??!??!H!B

毒株

I0&+$0$1.#3%!KE>=KE>?KEH对照

!

!!"

结果与分析

分离毒株!"#$、!"#$、""#%对感染鸡胚的致病性病鸡腺胃悬浮液接种鸡胚后的死亡率随着传代

的增加而增加：从第?代到第<代，所有分离株死亡率仅!BC，平均死亡的时间为?=B7，从第D代到第?!代死亡率高达E!C。平均死亡时间主要集中在FDGDH7。接种后H8，

未死亡鸡胚发育迟缓、出现侏儒胚，畸形，紧压头部卷曲成“抱头状”。!!!

分离病毒株在鸡胚中对#$%复制的干扰作用;:I,.1(%=B接种组，

接种后=D7的血凝效价为!EG?B，平均滴度为!EJ==；而病毒株!KE>、=KE>和?K

EHL;:I,.1(%=B接种组，血凝效价分别为!DG>、!DG>和!HGE，平均滴度分别为!DJ<、!>J?>、!DG>和!HJ?>。

这些结果显示，!KE>、=KE>和?KEH分离株明显影响早期;:I在鸡胚中的复制。!J&

分离病毒的血清交叉中和试验

MNI4=KE>和?KEH毒株与O<!、O1.3%和;毒株的交叉中和试验的结果显示：?KEH毒株和=KE>毒株的抗原相关值为?!JH，与;毒株为=?JD!；=KE>毒株与O1.3%的抗原相关值为<?JHH。?KEH和=KE>毒株与其它病毒株的抗原相关值很低（表?）。

表"

病毒分离株与其它毒株的抗原相关性

P#Q.%?

-(30’%(0,&%.#3%8(%$$1237%R0&+$0$1.#3%$#(8137%&MNI$3&#0($

?KEH

=KE>O<!

O1.3%

;

?KEH?BB=KE>?!JHH?BBO<!!J?!JH?BBO1.3%?JH<?JHH<JHE?BB;

=?JD!

!JHH

?EJ!>

!>J<F

?BB

!!’

分离毒株&’%(!"#$、&"#$和""#%的血凝特性

分离毒株MNI4!KE>、=KE>和?KEH第?B代感染

鸡胚尿囊液未经胰酶处理不能凝集鸡红细胞；但是?C的胰酶处理后，

对鸡红细胞有凝集作用（表!）。!!(分离毒株)"基因的*+(,-*

用设计的特异性引物，以分离毒株MNI4!KE>、=K

E>、?KEH的S;-为模板，

进行SP4@AS扩增，均可得到大约?JETQ大小的!"基因条带，与预期大小相符。（图?）。

#：6#&T%&（?BBG=BBBQV）；Q：MNI4?KEH株；,：MNI4!KE>株；8：MNI4=KE>株

"#(%#：:;-U#&T%&；"#(%Q：?KEH0$1.#3%；"#(%,：!KE>0$1.#3%；"#(%8：=KE>0$1.#3%

图"&’%(!"#$，&"#$，""#%!!基因,-*产物电泳X0’J?

Y.%,3&1V71&%$0$12SP4@ASV&18+,3$120(2%,301+$Q&1(,7030$R0&+$0$1.#3%$

!J)重组质粒的克隆和鉴定

连接产物转化#$%&’(J:O<!，涂于含氨苄青霉素、Z4’#.和M@P[的固体"N培养基上，选取白色菌落，提取质粒，电泳初步筛选重组克隆。再用Y,1SM和N#UOM双酶切，可切出两个片段（图!），小片段与@AS产物大小一致（?JETQ），大片段与VN)大小一致，证实所得克隆中成功地插入了目的基因。!!$

&’%(!"#$、&’%(&"#$、&’%(""#%毒株核苷酸和推

导的氨基酸序列分析

核苷酸序列测定表明，=个毒株!"基因的全序列均为?E=B个核苷酸（!KE>、=KE>、?KEH毒株的[%(N#(T登录号分别为：-\BF=!!B、-\BF=!?H、

-\BF=!?E）

。它们与其它MNI毒株!"基因比较，发现MNI4!KE>、=KE>、?KEH与O<!、:F?、O?!B、N%#+8%33%

及]^E>?之间的同源性很高，在EDJ=CGEEJ>C之间，而与A+P!、[&#/和O1.3%之间的同源性较低，在>=JDCG>>JHC之间。比较推导的氨基酸序列发现，MNI4!KE>、=KE>、?KEH与O<!、O?!B、:F?、N%#+8%33%及]^E>?之间的同源性与它们的核苷酸序列同源性一致，也在EDJ=CGEEJ>C之间，但与A+3!、[&#/和

/+LF5的氨基酸的同源性较之与其核苷酸的同源性

低，在?BJMN7B=JON之间。（表@）。!)&

$"%!!基因进化分析

将-9;<=(>?、@(>?和A(>B毒株!"基因核苷酸序列与已报道的一些-9;毒株的相应序列差异指数

进行分析，建立了A@个毒株的系统发育进化树（图，其中，@）-9;<=(>?、@(>?、A(>B与PQ>?A、/R=、/A=S、

核苷酸水平上的同源性高达%MA亲缘关系最近，

（89:-9;<=(!："!#$!%&’()*+,-./01$---2!3453；675：重组质粒双酶切产物>?、@(>?、A(>B、C!"基因）

"!15!："!#$!%&’()*+,-./01$---2!3453；"!156<5：$0D5EF0+183+$<（89:-9;<=(>?，G*FE+H35*+#601!1FE@(>?，A(>B，C:AD515）

尽管它们的组织嗜性不同；与TGU=、>>JSN以上，

它们属不同血清型。/+LF5和V3!K毒株的关系较远，

$讨论与结论

图!I0DJ=

重组子!"#$"%&!’"#，$’"#，%’"&，(!!基因的双酶切鉴定

-$51F0H0*!F0+1+H35*+#601!1FE（89:-9;<!"）$0D5EF5$6K)*+,-!1$9!#/-

来源于腺胃的=(>?、@(>?和A(>B毒株病料在

鸡胚中繁殖到第A=代，经理化特性、血凝特性测定，对新城疫病毒复制的干扰试验、抗原相关性等的分析和分离毒株!"基因的克隆及其序列测定，表明

表$不同$"%!!基因核苷酸和推导的氨基酸序列同源性A）

UW5W+#+L+DK+H1G*L5+F0$5!1$$5$G*5$!#01+!*0$E5XG51*5+HE5Y53!L-9;EF3!01E

PQ>?A!!!

>>J?>BJO>?J@>MJM?>JS>>JAB=JO>>JR>>JO?>JS>?JS>>JO

@(>?>>J?!!!>BJ>>?J@>MJR?>J=>>J=B=JO>>JO>>J??>JS>?J=>>J?

A(>B>BJO>BJ>!!!>OJ@>@JR?BJO>BJ@BAJB>BJR>BJO?BJM>OJA>BJO

95!G$5FFT+115*F0>?J@>?J@>OJ@!!!>MJ??>JM>?JAB=JM>?J@>?J@?>JS>?JR>?J=

>@J@>@JM>=JM>@JR!!!?BJ>>MJRBAJB>MJB>MJR?BJ?>RJ@>MJM

TGU=?MJ>?RJ=?MJ??RJM?@JO!!!?>JABAJR?>J=?>J=B=JA?>JS?>JS

%MA>>JS>>J=>BJ@>?JA>@J@?RJS!!!B=JR>>JR>>J=?BJB>?JA>>JA

V3!K??JO??JB?OJ>??JR?OJA?BJR??JO!!!B=JOB=JOBAJ=B=J=B=JR

/A=S>>JM>>JO>BJR>?J@>@JO?RJ=>>JM?>JS!!!>>JO?BJ>>?JR>>JR

/R=>>JO>>J?>BJO>?J@>@JM?RJ=>>J=??J?>>JO!!!?>JS>?J=>>JO

/+LF5?MJ=?MJ@?@JO?MJR?@JB?BJ??MJ=??JM?MJA?MJA!!!?BJR?BJB

2MA>AJ>>=JS>AJS>=J@B>JS?AJM>AJB?@JM>=J@>=JS?SJO!!!>?JS

=(>?>>JO>>J?>BJO>?J=>@J@?RJS>>JS??JO>>JR>>JO?MJS>AJ>U!6L5@

毒株

:F3!01EPQ>?A@(>?A(>B95!G$5FFT+115*F0TGU=%MAV3!K/A=S/R=/+LF52MA=(>?

A）

上三角核苷酸序列同源性；下三角氨基酸序列同源性!!!!!!UW5W+#+L+DK+H1G*L5+F0$5E5XG51*501G8853F30!1DL5；FW5W+#+L+DK+H$5$G*5$!#01+!*0$E5XG51*501L+Z53F30!1DL5

图$

I0DJ@

不同$"%!!基因进化树

UW58WKL+D515F0*F355+HA@-9;EF3!01E!**+3$01DF+FW503!"D515E

上述分离的毒株基本符合已报道的传染性支气管炎病毒特征。但分离毒株的热稳定性、酸碱及脂溶剂的敏感性、鸡胚的致病性等不同。同时从交叉中和试验结果看，分离的!"#$、%"#$和&"#’毒株在抗原性方面与已报道的()*毒株也存在较大的差异。

为了进一步研究和鉴定这些分离毒株，笔者在测定分离病毒株生物学及理化学特性的基础上，通过!"基因的克隆及序列分析发现，!"#$、%"#$毒株的核苷酸及氨基酸序列与嗜腺胃()*+,-#$&毒株的慧芳，朱坤喜.腺胃病变型鸡传染性支气管炎毒株2#3的研究.江苏农学院学报，&##/，&$（6）：33S3#.

,I9A^，]8GH=T，<9G[<，,ID9-2，,I98GHA2，=8G]]，]8GH)[，@J8G2Y，,I9T_.<;9:J7KDG2#3K;B8JGD\OIJON+7GJG\7O;JD9KMBDF7G;BJO9EJ;JK.#$%&’()$*#.(’/5%1/&.2%)8%&():$);（6）：33S3#（JG?IJG7K7）),/,，&##/，&$

［/］朱国强，严维巍，孙龙生，王碧林，万洪全，周继宏，庄国宏，王

永坤.腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒变异株的比较研究.中国兽医学报，（%）：!%%S!%/.&##’，&’

,I9A^，=8G]]，<9G[<，]8GH)[，]8G2^，,ID9-2，同源性均达##./01##.$0，而&"#’只有#’./0。这与,-#$&、!"#$和%"#$毒株来源于同一地区和同一发病时间，&"#’毒株来源于不同发病时间和地点密切相关（,-#$&、!"#$和%"#$毒株&##$年采集自浙江省某县同一发病时间的不同地区鸡场；&"#’毒

株&##’年采集自杭州市近郊某鸡场［$，’］

）。同时，!"#$、%"#$和&"#’与呼吸型疫苗毒株23!、2&!4、56&、)789:7;;7的核苷酸及推导的氨基酸也具有很高的一致性，但从腺胃分离()*+!"#$、%"#$、&"#’及,-#$&毒株具有一个明显不同于其它()*的特征，是<&蛋白在&/!位突变为酪氨酸（=）［其它()*毒株在此位点为天冬酰胺（>）］，这是否与组织嗜性的不同有关，尚待进一步研究。!"#$、%"#$和!"#’毒株与重组病毒?9@!、肾型AB8C和2DE;7毒株的核苷酸及氨基酸的同源性较低，说明()*+!"#$、%"#$、,-#$&毒株与其亲缘关系较远。!"#"$"%&"’

&］?8F8G8HI5，5FJKL-.?DBDG8FJB9K()*：FJB9KB7;8JGJGHKMJN7HEC+

ODMDECM7M;J:7<!P9;GD;<&JK9G8PE7;DJG:9O7FJB9K+G79;B8EJQJGHDBI87R8HHE9;JG8;JDG+JGIJPJ;JGH8G;JPD:C，DBJG:9O7OIJON7G;B8OI78EMBD;7O;JDG.#$%&’()$*+,’,&()-.&$)$/0，&#’/，/$：&6%3S&66!.

!］T8G;U，TDOIA，F8GVT，T9K;7BK-A，LD7EWJXNYU，*8G:7B

,7JXK;)UZ.[DO8;JDGD\8G;JH7GJOKJ;7K:7\JG7:PCG79;B8EJQJGHRDGD+OEDG8E8G;JPD:J7KDG;I7<&8FJ8GJG\7O;JD9KPBDGOIJ;JKFJB9KHEC+ODMDECM7M;J:7.#$%&’()$*+,’,&()-.&$)$/0，&##!，$%：3#&S3#/.

%］ZDDB7TZ，-8ONWDD:Z]，2JE;5U.(:7G;J\JO8;JDGD\8RJGD8OJ:K

JGFDEF7:JG8K7BD;CM78G:G79;B8EJQ8;JDGKM7OJ\JO7MJ;DM7WJ;IJG;I7K&K9P9GJ;D\8FJ8GJG\7O;JD9KPBDGOIJ;JKFJB9K.1&23.4,5-.&$)$/0，&##$，&6!：!!6#S!!3/.

6］周继勇，于

涟，洪

建，叶伟成，张志育.传染性腺胃炎病毒

分离及初步鉴定.浙江农业大学学报，&##’，!6（/）：/%$S/6&.,ID9-=，=9[，2DGH-，=7]?，,I8GH,=.(KDE8;JDG8G:MB7+EJRJG8BCJ:7G;J\JO8;JDGD\M8;IDH7GD\OIJON7GJG\7O;JD9KPBDGOIJ;JKFJB9K.#$%&’()$*63,7.(’/1/&.2%)8%&()9’.4,&5.80，&##’，!6（/）：/%$S/6&.（JG?IJG7K7）

3］朱国强，王永坤，孙龙生，周继宏，庄国宏，严维巍，王碧林，田

,I98GHA2，]8GH=T.?DRM8BJKDGK;9:J7KDG;I7F8BJ8G;D\JG\7O+;JD9KPBDGOIJ;JKFJB9KD\OIJON7GJG\7O;JD9KMBDF7G;BJO9EJ;JK.:3.’,5,#$%&’()$*-,8,&.’(&0!2.,’2,，&##’，&’

（%）：!%%S!%/.（JG?IJG7K7）［$］周继勇.传染性腺胃炎病毒,-#$&株的一些生物学特性.畜

牧兽医学报，!444，%&（%）：!!$S!%6.

,ID9-=.)JDEDHJO8EOI8B8O;7BJK;JOKD\JG\7O;JD9KMBDF7G;BJO9EJ;JKFJB9K（;7G;8;JF7G8R7）,-#$&JKDE8;7.:3.’,5,#$%&’()$*1’.<()(’=-,8;,&.’(&0!2.,’2,，!444，%&

（%）：!!$S!%6.（JG?IJG7K7）［’］周继勇.传染性腺胃炎病毒（暂定名）的致病性.中国兽医学

报，!444，!4（!）：&!6S&!$.

,ID9-=.L8;IDH7GJOJ;CD\JG\7O;JD9KMBDF7G;BJO9EJ;JKFJB9K（;7G;8;JF7G8R7）,-#$&JKDE8;7.:3.’,5,#$%&’()$*-,8,&.’(&0!2.,’2,，!444，!4

（!）：&!6S&!$.（JG?IJG7K7）［#］周继勇.传染性支气管炎病毒腺胃毒株（,-#$&毒株）结构蛋白

和!"基因的结构分析.中国兽医学报，!444，!4（3）：6!#S6%%.,ID9-=.<;B9O;9B8E8G8ECKJKD\;I7!"H7G7D\MBDF7G;BJO9E9KM8;IDH7GJOJG\7O;JD9KPBDGOIJ;JKFJB9K（,-#$&JKDE8;7）8G:J;KK;B9O+;9B8EMBD;7JGK.:3.’,5,#$%&’()$*-,8,&.’(&0!2.,’2,，!444，!4（3）：6!#S6%%.（JG?IJG7K7）

［&4］周继勇，沈行燕，程丽琴，丁红梅，吴建祥.新变异的禽传染

性支气管炎病毒,-#$&毒株!基因克隆及序列分析.中国农业科学，!44&，%6（6）：663S634.

,ID9-=，<I7G_=，?I7GH[^，5JGH2Z，]9-_.?EDGJGH8G:K7‘97GOJGHD\;I77G;JB7!H7G7D\8F8BJ8G;JG\7O;JD9KPBDGOIJ;JKFJB9K,-#$&JKDE8;7JG?IJG8.!2.,’8.(1/&.2%)8%&(!.’.2(，!44&，%6（6）：663S634.（JG?IJG7K7）

［&&］丁红梅，周继勇，沈行燕，吴建祥，程丽琴，于

涟.鸡传染性

支气管炎病毒嗜腺胃毒株（,-#$&）核衣壳蛋白的克隆.农业生

物技术学报，!44&，（#%）：!6%S!6/.

5JGH2Z，,ID9-=，<I7G_=，]9-_，?I7GH[^，=9[.?EDGJGHD\G9OE7D;J:7O8MKJ:MBD;7JGD\MBDF7G;BJO9E9KJG\7O;JD9KPBDG+OIJ;JKFJB9K（,-#$&JKDE8;7）.1/&.2%)8%&,>.$8,23’$)$/0!.’.2(，!44&，（#%）：!6%S!6/.（JG?IJG7K7）

［&!］周继勇，于

涟，马有智，李双茂，钱凯先.鸡肾型传染性支

气管炎病毒分离及鉴定.浙江农业大学学报，&##’，!6

（%）：%4%S%4$.

,ID9-=，=9[，Z8=,，[J<Z，^JG8T_.(KDE8;JDG8G:J:7G;J\J+O8;JDGD\8FJ8GNJ:G7C+;CM7JG\7O;JD9KPBDGOIJ;JKFJB9K.#$%&’()$*63,7.(’/1/&.2%)8%&()9’.4,&5.80，&##’，!6（%）：%4%S%4$.（JG?IJ+G7K7）

（责任编辑

林鉴非）

［［［［［