青杄PsbO基因cDNA序列克隆及生物信息学分析

青杄PsbO基因cDNA序列克隆及生物信息学分析 作者：刘亚静等。

第16卷第3期2012年6月

生命科学研究

LifeScienceResearch

Vol．16No．3Jun.2012

青杄PsbO基因cDNA序列克隆及生物信息学分析

刘亚静,李长江,孙

帆,张凌云*

(北京林业大学森林培育与保护教育部重点实验室,中国北京100083)

摘

要：利用RACE技术从已有的青杄均一化cDNA文库中克隆得到青杄（Piceawilsonii）PsbO基因cDNA的全

长,并用生物信息学的方法对该cDNA的核苷酸序列、氨基酸序列的相似性,及编码蛋白PwPsbO的理化性质、亲水性/疏水性、二级和三级结构,PwPsbO基因进化树等进行了预测和分析.采用实时荧光定量PCR（RT-

qPCR）技术,测定了青杄不同组织中的PsbO基因的相对表达水平.结果发现：青杄PsbO基因编码346个氨基

酸,预测相对分子质量为36.6kD,理论pI值为5.29,属于可溶性蛋白.二级和三级结构预测表明其含有较多的α螺旋、β折叠和随机卷曲结构.RT-qPCR发现该基因在青杄针叶和茎中表达量最高.这些结果为青杄中

PsbO基因的初步功能研究奠定了基础.

关键词：青杄；PsbO基因；RACE；生物信息学中图分类号：Q781

文献标识码：A

文章编号:1007-7847(2012)03-0201-06

cDNACloningandBioinformaticAnalysisofPsbOGene

fromPiceawilsonii

LIUYa-jing,LIChang-jiang,SUNFan,ZHANGLing-yun*

（KeylaboratoryofForestSilvicultureandConservationoftheMinistryofEducation,BeijingForestryUniversity,Beijing

100083,China）

Abstract：Full-lengthcDNAsequenceofPsbOgenewasacquiredfromnormalizedcDNAlibraryofPicea

wilsoniibyRACEmethods.Predictiononphysicalandchemicalproperties,hydrophobicity,phylogenetictree,secondaryandtertiarystructureofaminoacidwereanalyzedbybioinformatics.TherelativeexpressionlevelofPwPsbOindifferenttissuesusingquantitativerealtimePCR(RT-qPCR)wasmeasured.TheresultsshowedthatPwPsbOgeneencodes346aminoacids.Itsmolecularweightis36.6kDandthetheoreticalpIis5.29.Itisahydrophilicprotein.ThesecondaryandtertiarystructureofPwPsbOismainlycomposedofalphahelix,randomcoilandextendedstrand.ThehigherexpressionlevelofPwPsbOwasobservedinneedlesandstems.TheaimofthisstudyistolayafoundationforthefunctionofPsbOinPiceawilsonii.Keywords：Piceawilsonii；PsbO；RACE；bioinformatics

（LifeScienceResearch，2012，16（3）：201～206）OEE1(oxygen-evolvingenhancerprotein1,

MSP,33kD蛋白)是由核基因锰簇稳定外周蛋白PsbO基因编码的定位于叶绿体的33kD蛋白,结合在类囊体膜内的光系统Ⅱ的外缘,是与放氧关系最为密切的外周蛋白,在维持光系统Ⅱ复合体的稳定方面发挥重要作用[1].自从Yamamoto等第

收稿日期：2012-02-24；修回日期：2012-03-29

基金项目：国家转基因生物新品种培育科技重大专项资助项目（2009ZX08009-062B）

*作者简介：刘亚静(1987-),女,河北衡水人,硕士研究生,主要从事植物抗逆基因的克隆和功能研究,E-mail：liuyajing1987@http://wendang.chazidian.com；通

一次从光系统Ⅱ膜上纯化出OEE1蛋白之后[2],对

该蛋白以及编码该蛋白的PsbO基因的研究一直都未停止过.

光合系统是对外界逆境响应最为敏感的部分,极易引发产生活性氧,造成光合系统破坏,出现光抑制情况.Mn簇是否稳定对光系统Ⅱ光抑

讯作者：张凌云（1973-）,女,北京林业大学森林培育学科副教授,主要从事植物发育与生殖生物学研究,E-mail：lyzhang73@http://wendang.chazidian.com.

青杄PsbO基因cDNA序列克隆及生物信息学分析 作者：刘亚静等。

202生命科学研究2012年

制产生活性氧的过程会产生重要影响.PsbO可能直接影响Cl-在光系统Ⅱ放氧反应中与活性位点的结合或者作用的发挥[3].将PsbO蛋白从膜上去除会导致在低Cl-浓度下Mn簇4个Mn原子中的2个从膜上脱落[4].另有许多证据表明PsbO蛋白与CP47之间存在结合,保护CP47免受限制性蛋白酶的降解,去除PsbO蛋白以后,CP43、Cytb559的α亚基易被胰蛋白酶剪切[4,5].拟南芥的PsbO2涉及在高光条件下调节D1蛋白的运转,具有维持光系统Ⅱ的功能[6].因此,OEE1蛋白很有可能参与光合放氧生物在光照胁迫时的保护机制[5,7].

杨传平等应用SSH技术研究盐胁迫下柽柳相关基因的表达情况,获得了36个盐胁迫响应基因,其中就包括PsbO蛋白基因[8].SugiharaK等发现木榄在500mmol/LNaCl胁迫下OEE1蛋白表达的表达增强[9].这些研究表明PsbO蛋白很可能参与逆境条件下的胁迫响应过程.最近,有关人员预测PsbO蛋白可能也发挥包括酶活性调节、反应中心蛋白翻转的调控、类囊体膜结构的调整等功能[10,11],这可能预示着PsbO在其它更多方面的新功能的发现.

本文以青杄为研究对象,成功克隆得到青杄中PsbO基因的全长cDNA,利用生物信息学的方法对该cDNA核苷酸序列、氨基酸序列的相似性、理化性质、亲水性/疏水性、二级和三级结构、进化树等进行了预测和分析,并用RT-qPCR方法分析了PsbO基因在青杄不同组织中的相对表达水平,旨在为进一步进行PsbO基因的功能研究奠定科学基础.

均购于美国Promega公司.

1.2实验方法

1.2.1利用RACEPCR获取PwPsbO基因的末端

序列

以多年生青杄cDNA文库（本实验室已构建）为模板,利用PsbO的EST序列中特异引物与PDONR222两端的载体引物进行5′-RACE与3′-RACE实验.5′-RACE实验利用上游引物5PR-L与下游引物5PR-R(见表1),3′-RACE实验利用上游引物3PR-L与下游引物3PR-R(见表1)进行扩增.通过EST片端与5′端、3′端序列的拼接,得到PsbO基因的全长cDNA序列.

1.2.2PwPsbO基因的生物信息学分析

利用DNAMAN软件进行PwPsbO的cDNA序列编码框预测及蛋白翻译.通过NCBI(http：//

//www.ara-www.ncbi.nlm.nih.gov/)与TRIR(http：http://wendang.chazidian.com/)网站中的BLASTn与BLASTp工具进行核酸序列与蛋白序列的同源性分析,用CLUSTALX软件进行多序列比对,用MEGA5进行系统树的构建；利用ExPASy(http：//http://wendang.chazidian.com/tools/)中的ComputepI/Mw工具(http：//http://wendang.chazidian.com/compute_pi/)预测其等电点和相对分子质量,利用ProtScale工具(http：//http://wendang.chazidian.com/protscale/)计算蛋白的疏水性图谱；利用TMHMM工具(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMH-MM-2.0/)预测蛋白是否跨膜；利用SWISS-MODEL工具来预测蛋白的二级和三级结构.

1.2.3利用RT-qPCR进行PwPsbO基因的组织

表达分析

1材料与方法

1.1

实验材料

利用Aidlab公司RNA提取试剂盒提取两年生青杄的根、茎、叶与多年生青杄的种子和花粉的RNA.利用Fermentas公司的RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit合成双链cDNA.根据PwPsbO的CDS设计特异引物QRT-L、QRT-R(见表1).选用青杄EF-1α基因为内参基因,并设计引物EF-1α-L和EF-1α-R(见表1).利用KAPA公司的SYBRFASTqPCRKit（ABIprismTM）在ABIStepOnePlus实时荧光定量PCR仪进行RT-qPCR实验,分析PwPsbO在青杄5种不同组织中的相对表达情况.

多年生青杄（Piceawilsonii）的花粉和针叶,由中科院植物所北京植物园提供.供试花粉于室温下自然风干,贮藏于-20℃冰箱.供试针叶用液氮速冻,贮藏于-80℃超低温冰箱.用Gateway技术构建青杄cDNA文库,由英俊生物公司构建.两年生青杄的根、茎、叶用于进行RT-qPCR实验.TaqDNA聚合酶、DL2000购买于中国TAN-GENG公司,pDONR222载体购买于美国Invitro-gen公司,反转录试剂盒购买于加拿大Fermentas公司,荧光定量PCR试剂盒购买于美国KAPA公司,pEASY-T1购买于中国全式金公司,其它试剂

2

2.1

结果

通过RACE实验获取PwPsbO的cDNA全长

对5′RACE和3′RACE实验获取的片段进行

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第3期

表1

刘亚静等：青杄PsbO基因cDNA序列克隆及生物信息学分析203

cDNA克隆和RT-qPCR所用引物序列

Table1TheprimersusedinthecDNAcloningand

RT-qPCR

Primers5PR-L5PR-R3PR-L3PR-RQRT-LQRT-REF-1α-LEF-1α-RPsbO-LPsbO-R

Sequences

CAGTCTTAAGCTCGGGCCCCACAGCGCGGATCCTGTTGCGAGGCCTCGCAACAGGATCCGCGCTGCTGCCAGGAAACAGCTATGACATGGCCGCGTCCCTCGCAACAGAAGGCCCTTGAGAGGTTCGAGGAACTGGAGAAGGAACCCAAGAACGACCCAATGGAGGATACATGGCCGCGTCCCTCGCAACAGTCAATTTGTGCATACCATGGG

测序,并且将测序结果与EST片段拼接获取cDNA全长(图1).设计引物PsbO-L与PsbO-R,用PCR扩增PwPsbO的编码区,将片段连接pEASY-T1载体上酶切和测序进行鉴定.2.2

PwPsbO的氨基酸组成与理化性质分析应用DNAMAN对PwPsbO的全长cDNA序列进行分析发现：PwPsbO的全长cDNA共1260bp,在54bp出现起始密码子ATG,在1092bp处发现终止密码子TGA,在1248bp处出现PolyA尾巴,编码区由1041bp核酸组成,编码346个氨基酸（核苷酸和氨基酸序列见图1）.应用ComputepI/Mw工具预测相对分子质量为36.6kD,理论pI值为5.29.

2.3PwPbsO推导的氨基酸序列的的疏水/亲水

性分析

氨基酸的疏水性和亲水性是氨基酸的固有特性,蛋白结构的稳定性在很大程度上依赖于氨基酸的疏水特性.我们利用ProtScale工具(http：//http://wendang.chazidian.com/protscale/)计算蛋白的疏水性图谱,对PwPbsO蛋白的疏水性和亲水性进行了分析.发现第159位的赖氨酸（Lys）、160位天冬酰胺酸（Asn）、163位的脯氨酸（Pro）疏水性最差是-2.467,79位的丙氨酸（Ala）疏水性最强是2.256.大部分的氨基酸属于亲水性氨基酸,因此预测PwPbsO为可溶性蛋白（见图2）.2.4

PwPsbO基因与多种植物的序列比对及系统我们将PwPsbO蛋白的氨基酸序列与拟南芥、玉米、杨树、木榄、毛竹、葡萄等物种（表2）的序列进行了多序列比对,发现PwPsbO蛋白和其他PsbO蛋白类似,含有较多的α螺旋以及β折叠结构[12]（图3）.并用MEGA5进行了系统树的构建（图4）.结果发现,青杄PsbO基因和毛竹、玉米

进化树分析

图1PwPsbO的核苷酸序列和氨基酸序列

氨基酸序列用单个字母表示,下划线标记为转录起始密码子ATG和转录终止密码子TGA；氨基酸碳末端用星号表示,PolyA信号用黑体表示.

Fig.1Nucleotidesequencesanddeducedsequenceofa-

minoacidresiduesofPwPsbO

Theaminoacidresiduesareindicatedbyasinglelettercode.Apotentialtranslationinitiationcodon(ATG)andaterminationcodonareunderlined；theCterminalofse-quenceofaminoacidresiduesismarkedwithasterisk；thepotentialpolyadenylationsignalsitesaremarkedin

bold.

的亲缘关系最近.

2.5PwPsbO的二、三级结构分析

我们利用GOR4在线工具做了PwPsbO蛋白的二级结构预测,发现该氨基酸序列含有23.99%的α螺旋结构（Alphahelix）,21.97%的β折叠（Extendedstrand）,54.05%的随机卷曲（Randomcoil）,这个结果（见图5）和以往的研究成果基本类似,但具体的结构尚需实验印证.应用SWISS-MODEL工具来预测PwPsbO蛋白的三维结构也得到了类似的结果（图6）.

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204生命科学研究2012

年

ProtScaleoutputforusersequenoe

2.52.01.51.00.5Score

0-0.5-1.0-1.5-2.0-2.5

50

100

150

200

250

300

Hphob.

/Kyte&Doolittle

Position

PwPsbO蛋白的疏水性分析图谱Fig.2HydrophobicanalysisofPwPsbO

表2

图2

Table2

Species

ArabidopsisthanlianaPopulustrichocarpaBruguieragymnorhizaZeamays

PhyllostachysedulisVitisvinifera

Nicotianabenthamiana

PwPsbO的同源基因

HomologicalgenesofPwPsbO

GeneAtPsbO1AtPsbO2PtPsbOBgPsbOZmPsbOPePsbOVvPsbONbPsbO1

Evaluee-126e-12500

3e-1802e-9700

AccessionAT5G66570AT3G50820XP_002310188AB043960ACG31595ABV57472XP_002274796AAX53163

图3不同植物的PsbO蛋白多序列比对结果

Fig.3Themultipleproteinsequencesalignmentresult

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第3期刘亚静等：青杄PsbO基因cDNA序列克隆及生物信息学分析205

BgOEP1

NbPSBO1VvPSBO1

所提取的RNA进行OD260/280检测分析,OD值大小介于1.8～2.0之间,说明提取的总RNA纯度比

AtPSBO1AtPSBO2

PwPSBO1

较好,可以用于后续实验．

将上一步提取的各组织RNA通过加拿大Fermentas公司的RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit合成双链cDNA试剂盒反转录为cDNA.利用KAPA公司的SYBRFASTqPCRKit（ABIprismTM）在ABIStepOnePlus实时荧光定量PCR仪进行RT-qPCR实验.设置阴性对照和空白对照,每次试验设置3个重复,得到PsbO基因在不同组织中表达情况的RT-qPCR的结果（图8）.结果显示,PsbO基因在青杄的茎和叶中的表达量最高.

ZmOEP1PePSBO

0.02

图4不同植物间PbsO基因系统树

Fig.4PolygenetictreeofPbsOabout8kindsofdiffer-entplants

2.6

PwPsbO基因在不同组织中的表达情况分别提取青杄根、茎、叶、花粉、种子5种组织

的总RNA.经过1.2％琼脂糖凝胶电泳(110V,15min),18S和28S条带明显(图7).接下来我们对

50100150200

250

图5PwPsbO蛋白的二级结构预测图

紫色代表随机卷曲,红色代表α螺旋结构,蓝色代表β折叠.

Fig.5ThesecondarystructureofproteinPwPsbOpresentedbyGOR4

Thepartofpurple/red/bluerepresenttherandomcoil/alphahelix/extendedstrand.

28S18S

root

stem

needles

pollen

seed

图7青杄各组织RNA提取结果

Fig.7

3.53.0Relativeexpression

2.52.01.51.00.5

TheresultofRNAoffivetissuesinPiceawilsonii

图6由SWISS-MODEL工具预测的PwPsbO蛋白的三级结构

Fig.6ThetertiarystructureofproteinPwPsbOpresent-edbySWISS-MODEL

3结论与讨论

图8

root

stem

needlespollen

seed

以青杄cDNA文库为模板的RACE实验是基于EST保守序列和pDONR222载体上特异的引物进行的,因此cDNA全长是由PsbO的末端序列和EST序列进行拼接而来的,进而完成基因的克隆.本研究成功获得了青杄PsbO基因的cDNA序列并推导出了它的氨基酸序列.青杄PsbO基

PwPsbO基因在两年生青杄的相对表达情况

Fig.8TranscriptaccumulationofPwPsbOin2-year-oldtrees

因的全长cDNA共1260bp,包括1041bp的完整的53bp的5′非翻译区(5′siteuntranslatedre-gion,5′-UTR),368bp的3′非翻译区(3′-UTR)以及