鲍血淋巴抗菌肽的研究

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苏秀榕１

宋林生２

浙江　宁波　　　　　３１５２１１

山东　青岛　　　　　２６６０７１

浙江　宁波　　　　　　３１５０１０）

不同诱导时间所产生的抗菌肽抑菌活性不同

摘　　　要

这类抗菌肽具有热稳定性

６０００Ｄａ左右

杂色鲍

抗菌肽

Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｏｆ　　Ｈａｌｉｏｔｉｓ　ｏｉｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ　Ｒｅｅｖｅ　Ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ

ＬＩ　Ｙｅ１ＬＩ　Ｔａｉ－ｗｕ１ＨＵＡＮＧ　Ｂｉｎ３

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｎｉｎｇｂｏ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｎｉｎｇｂｏ　　　　３１５２１１，　Ｃｈｉｎａ

３．Ｎｉｎｇｂｏ　Ｏｃｅａｎ　ａｎｄ　Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，　Ｎｉｎｇｂｏ　　　　３１５０１０，　Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ　

６０００Ｄａ）．

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ

ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ

Ｑ５１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文献标识码

１００２－６６３０（２００５）０５－００６７－０４

纲（Ｇａｓｔｒｏｐｏｄａ）

（Ｈａｌｉｏｔｉｉｄａｅ）动物不但味道鲜美白氨基酸种类丰富

ＥＰＡ

腹足鲍科

鲍的肌肉组织

其营养成分具有高蛋

明显促进了鲍的生长［１０］

过研究鲍的免疫系统

通

基因调控方式

目前对鲍免疫系统的研究还不多

鲍的免疫系统也被认为由细胞免疫和体液

免疫组成增生作用巴中溶菌酶

体液免疫包括血淋

抗菌蛋白（或肽）等因子的作用［１１］

［１４］

血淋巴的溶

菌认为是菌诱导提高了血淋巴中溶菌酶和抗菌肽等类似抗菌物质浓度［１５］

以大肠

杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）为诱导源

为贝类的病害防治奠定基础

这必然带动鲍的养殖业

国鲍的人工养殖始于８０年代中期

但是

鲍的养殖业在近几年来面临严重的病害威胁观察［２］［５］

提高鲍的抗病能力［６，７］

改善养殖环境

我

病理

如李太武等以河

流弧菌

对鲍的脓胞病具有明

显的治疗效果［８，９］

收稿日期

中国科学院实验海洋生物学重点实验室第八批开放课题基金资助

作者简介女研究方向为食品安全与毒理学

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购于宁波市水产品大世界

６ｃｍ

用ＬＢ

液体培养基于３

７１．２方法１．２．１

诱导

将经活化的大肠杆菌接种于ＬＢ液体培养基于

３７

４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ

１０７ｃｅｌｌ／ｍｌ（Ａ５７０ｎｍ＝０．７７２）

每组五只第一组

干露５ｈ

鲍的腹足注射菌液５０

诱导５ｈ四组

诱导时间８ｈ

和１２ｈ

加热除去分子量较大的蛋白质于

４

１００００ｒ／ｍｉｎ

取上清

即鲍

的血淋巴提取液

储存备用

取

浓度为

１

ｌ

倒入预先准备的下层培养基上

放上牛津杯

ｌ过滤除菌后的样

品

培养１８ｈ

判断样品的

抗菌活性

用杯碟法比较抑菌活性

多肽的种类及浓度

的水浴中加热

１０ｍｉｎ

离心２０ｍｉｎ

用蒸馏水作对照

依次调ｐＨ到５．０３．０静置３０ｍｉｎ１０，０００ｒ／ｍｉｎ

４离心２０ｍｉｎ

冷冻干燥后

用双蒸水

定容到原体积

１．２．３．５

溶血

加入肝素抗凝剂离心５ｍｉｎ

用吸

管吸去上层血浆混合后

离心５ｍｉｎ

最后加入生理盐水

储存备用

ｌ

显微镜下观察溶血和凝血现象

１．２．３．６

分子量测定　　　　采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测鲍血淋

巴提取液的分子量测定

用１２．５％的聚丙烯酰胺凝胶

电泳后分离随着诱

导时间的增加酶谱染色浓度变

深

注

２－诱导５ｈ

４－诱导１２ｈ

图１　　　不同诱导时间鲍血淋巴提取液抑菌活性比较Fig.1 Antimicrobial activity of hemolymph

２．２

热稳定性　　　　鲍血淋巴提取液经过加热处理

注６－加热产物

图２　　　诱导８ｈ后鲍血淋巴提取液加热后的抗菌活性

Fig.2 Antimicrobial activity of hemolyomph dealed with heat

２．３

三氟乙酸处理后仍具有抗菌活性（图３）

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不凝血性　　　　按上述两种比例在血细胞中

加入加热产物

也没有凝集作用（图７）

６０００Ｄａ之间（图５

注８－超滤产物

图４　　　　超滤产物的抑菌活性

Fig.4

Antimicrobial activity of filted-production

图５　　　不同诱导时间的ＰＡＧＥ电泳结果

Fig.5 The result

of PAGE

注

３６．０

３讨　　论

３．１抗菌肽作为一种免疫因子在无脊椎动物中广泛存

在

人们又相继从其

他脊椎动物

这些天然的抗菌肽有一些共同的特征

血细胞

注

１８－按１：１加入鲍血淋巴液后的小鼠血细

胞

凝血活性

Fig.7 The effect of hemolymph on eukaryotic cells

分子量在１００００Ｄａ以下

多数分子的等电点大于７广谱的抗菌活性

真菌

但对真核细胞无毒害［１７］

抗菌肽基因的转录

不受外界刺激物的影响储存在血淋巴颗粒细胞中

鲍属无脊椎动物

这些体液因子主

要包括溶酶体酶溶血素和抗菌蛋白或抗菌肽［１１］

杂色鲍的血淋巴经大肠杆菌诱导

可产生具有免疫功能的蛋白和多肽（图５）

血淋巴的抑菌活性也增强（图１）

电泳结果显示其分子量在６０００Ｄａ左右

（图６）

只是这种刺激可以明显增加它们在血淋巴

中的浓度

诱导８ｈ后鲍血淋巴

中的抗菌因子浓度达到最大酸处理，除去

杂蛋白可提高多肽的抗菌活性

图７的小鼠溶血实验表明

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［８］

李太武，　丁明进，　等．　

皱纹盘鲍对河流弧菌

排除了抗菌因子为凝集素或溶血素的可能

另一方面

为这种抗菌物质的开发应用奠定了

基础

验通过研究鲍血淋巴中的抗菌肽

提高鲍的抗病能力

关于鲍抗菌肽的提纯

基因分析正在研究中

本实

［１］［２］［３］

易美华，　王锡彬，　等．　海南鲍营养成分及活性物质的分析研究［Ｊ］．　农牧产品开发，　１９９７，　１２：　３５－３８．

王军，　苏永金．　１９９９年春季东山九孔鲍暴发性病害研究［Ｊ］．　厦门大学学报（自然科学版），　１９９９，　３８（５）：　６４１－６４４．王崇明，　杨冰．　应用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法检测皱纹盘鲍致

创伤弧菌的研究［Ｊ］．　海洋水产研究，　１９９９，　２０病病原

（１）：　３０－３４．

河聂丽平，　刘金平，　李太武．　皱纹盘鲍脓胞病病原菌

）的生物学性状研究［Ｊ］．　中国流弧菌

微生态学杂志，　１９９５，　７（１）：　３３－３６．

姜明，　刘云．　皱纹盘鲍肠上皮组织立克次体超微结构与细胞病理学研究［Ｊ］．　青岛海洋大学学报，　２００２，　３２（６）：　９１４－９１８．陈毕生，　王江勇，　等．　杂色鲍养殖模式与病害流行趋势［Ｊ］．中国渔业经济，　２００１，　（１）：　４２－４３．

吕军仪，　刘燕燕，　李秉记．　不同技术措施控制杂色鲍暴发性流行病的效果比较［Ｊ］．　中国水产科学，　２００２，　９（２）：　１４７－１５１．

［４］

［５］

［６］［７］

日本用米糠开发的食品原料

制饮料烯酸等营养

矿物质

过滤

如添加０．５％果胶

作食品工业原料广用于食品工业中

可与其他酿酒原料米粉

加适量食盐

可作食品佐料

在一定温度下

用糖化酶处理后高温加热

加液化酶液化

制取饴糖及透明糖液

工艺为糠饼粉碎润料

糖业离心分离

取各原料之长

制酱熬糖

脂肪

蛋白质

ＶＢ族

分离渣

生育三

多功能保健性特点

米糠饼（提取油后的米糠渣）可生产５０度白酒约２５斤

所需时间仅为自然发酵法的１／７