鲑点石斑鱼细菌病原的分离鉴定和致病性

第9"卷第!期$##$年8月

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中山大学学报（自然科学版）

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鲑点石斑鱼细菌病原的分离鉴定和致病性!

黄志坚，何建国

（中山大学生命科学学院，广东广州!"#$%!）

摘

要：对海南省三亚地区网箱养殖的发病鲑点石斑鱼（!"#$%"&%’()*+,#-）进行病原分离，通过常规细菌学鉴

定和应用&’(半自动鉴定系统及)*’+,-&./-0#自动微生物鉴定系统，并与有关的标准菌株为对照，鉴定为溶藻弧菌（.#/,#-+’0#$-’12#3()）。小鼠毒性实验和不同方式感染鲑点石斑鱼实验的结果表明，该菌对小鼠有极强的毒力，不同感染方式感染鲑点石斑鱼表现不同程度的致病性。同时测定了溶藻弧菌对小鼠和鲑点石斑鱼的12!#分别为34$5"#!个671和$4"5"#%个671。进一步比较溶藻弧菌对青石斑鱼（!"#$%"&%’()-4-+,+）、真鲷（5+0,-)-6()、平鲷（8&+/9-)+,0())+,/+）、黑鲷（:"+,()+(,+2+）、红鳍笛鲷（;(27+$()%,12&-"2%,()）、黄斑蓝子鱼（:#0+$()6+7-,）

等一些常见海水养殖鱼类的致病性，该菌能导致不同海水养殖鱼类死亡并表现一定程度的症状。-,+6#+）

关键词：鲑点石斑鱼；溶藻弧菌；致病性中图分类号：/89"

文献标识码：&

文章编号：#!$8-0!%8（$##$）#!-##09-#9

"43

实验鱼

石斑鱼（!"#$%"&’%():;4）为暖水性礁栖鱼类，广泛分布于印度洋和太平洋的热带、亚热带海域，是驰名世界的海鲜珍品之一。鲑点石斑鱼（!"#<$%"&%’()*+,#-）又称为芝麻斑石斑鱼，是石斑鱼的主要养殖品种之一。细菌病是石斑鱼养殖中的主要病害之一，严重时死亡率高达%#<=>#<，造成巨大的经济损失。作者从患病石斑鱼分离多株致病菌，鉴定为溶藻弧菌（.#/,#-+’0#$-’12#3()），并研究该菌对小鼠和鲑点石斑鱼的毒力和致病性，同时比较研究该菌对常见海水养殖鱼类的致病性。

鲑点石斑鱼及青石斑鱼（!"#$%"&%’()-4-+,+）、真鲷（5+0,-)-6()6+7-,）、平鲷（8&+/9-)+,0()、黑鲷（:"+,()+(,+2+）、红鳍笛鲷（;(27+$())+,/+）

、黄斑蓝子鱼（:#0+$()-,+6#+）等其他海%,12&-"2%,()）

水养殖鱼类来源于广东省惠州市广东省大亚湾水产增养殖种苗培育中心。健康鱼均质量为3#=9#D，

饲喂于圆形塑料水族箱（约3#1）中，充氧，上覆盖纱网，%G无异常后用于感染试验。"49小鼠

来源于广东省医学实验动物中心，P*L纯系，">=$$D，雌雄各半。饲喂%G无异常后进行致病力试验。"4!

鉴定仪器

"4!4"自动微生物鉴定系统采用广东省老年医学研究所实验中心的美国自动微生物鉴定系统（)*’+,-&./-0#），鉴定板为美国进口Q"3$,革兰氏阴性菌种鉴定卡（OP*）。

"4!4$半自动微生物鉴定系统采用法国生物梅里埃公司的&’(半自动微生物鉴定系统，鉴定条为OP*23$。

"40鲑点石斑鱼细菌病病原分离

取不同来源的濒死鲑点石斑鱼，用酒精消毒体表，以无菌操作取病鱼病灶、肝、肾、脾、腹水、胃肠组织等，无菌剪刀剪一小缺口或将组织剪碎后

"

"4"

材料和方法

菌

株

)?-"至)?-%菌株系从患病鲑点石斑鱼分离，)?->菌株、)?-8菌株、)?-""菌株、)?-"3菌株分别为西班牙马拉加大学2@4.A@BCBDA，美国伊利诺伊大学EFB-GACDHIAJ，日本名古屋大学.@4.BKIBALA77?和日本东京大学海洋研究所.@4,?MJIBA,ADJ@F赠送，)?-"#菌株和)?-"$菌株分别购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（NO.NN）和中国医学细菌保藏中心（N.NN）。"4$

患病鲑点石斑鱼

来源于海南省三亚南海水产研究所热带水产研究开发中心和广东省惠州市广东省大亚湾水产增养殖种苗培育中心。

!收稿日期：$##$R#3R#9

基金项目：国家“>03”计划基金资助项目（$##"&&0$$#$#）；广东省科技厅资助项目（&3#!#$#"）作者简介：黄志坚（"8%#年生），男，博士；通讯联系人：何建国；+-7?BS：B:T@K#!UM:J4FGJ4KC

第A期黄志坚等：鲑点石斑鱼细菌病原的分离鉴定和致病性CA

用无菌匀浆器匀浆。然后用接种环在!"#$%&’(（!)*+）琼脂平板上划线接种，于,-.下培养*-/,01，在平板上出现较多形态一致的菌落，选取单个菌落进行纯化，以供鉴定和感染试验用。同时接种!’2"琼脂培养基以进行初步鉴定。*34

致病力检测

将菌株接种于!"#$%&’(（!)*+）琼脂斜面，,-.培养*-/,01，用无菌52"液（6743,）洗下制成悬液，参照麦氏比浊管调整菌液浓度成,

,3*

结果

病原菌培养特性

在不同来源病鱼的不同组织分离到较多细菌，

通过平板划线纯化，比较L&T*至L&T4各菌株的菌落特点及主要的生物学特性，选取L&T*，L&T,，L&T:菌株供试验用。

L&菌株在!"#$%&’(（!)*+）培养基上生长旺盛，可形成湿润、光滑、圆形、混浊的菌落，8’9:管（;<*=-个>?@）

，然后腹腔注射小白鼠，采用不同方式感染鲑点石斑鱼，并用肌肉注射方式感染其他海水鱼类，剂量为=30?@>尾（只）。对照组注射无菌52"液（6743,）。注射后消毒小白鼠体表，置于鼠笼中喂养。

鲑点石斑鱼和其他海水鱼类置水族箱（约:=@）中饲养，充氧，水温控制在,43:/:,30.，盐度,43-/:A3:B>@，67-3**/-3AC，溶解氧A3A*/C34:?B>@

。逐日观察，记录发病及死亡情况。

图*溶藻弧菌菌体形态（示鞭毛）（<,====）9DB3*

!1EF1&6E&GHI(&BE((J?KILDMNDK&(BDGK(OPDQJF

JGHENE(EQPNKG?DQNKFQK6E

箭头：示鞭毛

*3-对小鼠、鲑点石斑鱼@RA=的测定

将一定浓度的菌液梯度稀释，分别感染小鼠和

鲑点石斑鱼，按SEEHT8JEGQ1方法计算@RA=。*3;

病原菌回收和重复感染

选取致病力较强的L&T:菌株感染鲑点石斑鱼，

从发病鱼分离得到L&T:T*，再将L&T:T*感染健康鲑点石斑鱼，以证实其致病性。*3*=

病原菌细菌学常规鉴定

参照文献［*U:］

，按常规鉴定方法测定菌株的生

理生化特性和糖醇发酵特性，同时以标准菌株为对照进行系统鉴定。*3**

鉴定系统鉴定

将选取菌株接种!"#$%&’(（!)*+）培养基，用LV!WXT#8"TC=自动微生物鉴定系统和生物梅里埃公司的#!2半自动微生物鉴定系统鉴定。

大小约*/,??。在!’2"（硫代硫酸盐>柠檬酸盐>胆盐>蔗糖）培养基上形成约,??大小的黄色菌落。生长!（%&’(）为=3A+/*,+范围，但在无盐蛋白胨水中不生长。生长温度范围*=/0A.，在A.和A=.不发育。于67A/*,范围均能生长，最适67C/*=。,3,

病原菌菌体形态和生物学特性

经过筛选比较，选取L&T*、L&T,、L&T:菌株以及L&T-至L&T*:菌株进行细菌学鉴定。L&菌株为革兰氏阴性菌，直或弯曲，单个或偶尔联成"形或螺旋形，通常在固体培养基上以单极生鞭毛运动*），在液体培养基中以丛生或侧生多鞭毛运动。没有荚膜，不形成芽孢。其生理生化特性和糖醇发酵特性见表*。经鉴定为溶藻弧菌（!"#$"%&’()

"*%’+,"-./）。,3:

细菌鉴定系统测定结果

#!2半自动鉴定系统和LV!WXT#8"TC=自动鉴

定系统测定的结果与细菌学鉴定结果一致，也为溶

藻弧菌（!"#$"%&’("*%’+,"-./）。

,30对小鼠的毒力

在一周的感染试验期内，感染的小鼠表现为竖毛，匍匐不动，呼吸困难。不同菌株表现为不同程度的毒力，其中以L&T:、L&T*=、L&T*,菌株对小鼠的致病力最强，小鼠死亡率达*==+，其他菌株表现为不同程度的致病力，小鼠死亡率为A=+/;=+。对照组小鼠仍健活。,3A

不同方式感染鲑点石斑鱼

L&U:菌株不同方式感染鲑点石斑鱼，在实验期内表现为不同程度的致病力。其中以肌肉注射方式感染的鲑点石斑鱼死亡率较高，达*==+，症状最为明显，表现为背部肌肉溃烂，烂尾，胸鳍腹鳍基部出血，眼球突出，混浊，腹部膨胀，有腹水，肝脏灰白，肾脏充血，多在一周内死亡，与自然发病的病鱼症状一致，致病力最强。其次是腹腔注射和划痕浸泡感染方式，死亡率为-=+，未划痕浸泡感染和口服感染组也有一定的致病力，死亡率分别为0=+和C=+。对照组的鲑点石斑鱼没表现任何症状。

（图

KK中山大学学报（自然科学版）第L!卷

表!

$#%&!

项目

"#菌株的生理生化特性

项目

"#7!"#78"#79"#7:"#7;"#7!<"#7!!"#7!8"#7!9

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"#7!"#78"#79"#7:"#7;"#7!<"#7!!"#7!8"#7!9

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

革兰氏染色=>=>=>=>=>

氧化酶?????过氧化氢酶?????动力性?????

@ABE&F"&G吲哚@HG=淀粉水解I8J脲酶麦芽糖甘露糖

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精氨酸双水解酶>苯丙氨酸脱氨酶>赖氨酸脱羧酶鸟氨酸脱羧酶

??

@A!8;（!C<!D）?液化明胶?柠檬酸利用>

葡萄糖蔗糖甘露醇乳糖肌醇水杨素阿拉伯糖

???>>>>

硝酸盐还原?

8&K感染常见海水养殖鱼类

用"#79菌株采用肌肉注射方式感染鲑点石斑

菌。研究中测定菌株的生物学特性与有关文献报道

［8，9，L>:］的一致。

鱼、青石斑鱼、真鲷、平鲷、黑鲷、红鳍笛鲷、黄斑蓝子鱼等L科M种海水鱼类，均具较强的致病

性。在M0实验期内表现不同程度的致病性和感染症状，大多体色较黑，背部肌肉溃烂，有的露出骨头，尾柄处鳞片脱落，烂尾，胸鳍腹鳍基部出血，眼球突出，混浊，腹部膨胀，有腹水，肝脏灰白，肾脏充血（表8）。8&M

对小鼠和鲑点石斑鱼的NOC<

不同浓度的"#79菌液皮下注射感染小鼠和肌肉注射感染鲑点石斑鱼，在M0的试验期内表现不同的死亡率，按F7E方法计算"#79对小鼠的NOC<为9&8P!<C个A2N，对鲑点石斑鱼的NOC<为8&!P!<M个A2N。8&:

回接感染结果

从"#79菌感染的鲑点石斑鱼分离到"#797!菌，用"#797!菌感染健康鲑点石斑鱼，也表现较强的致病性，死亡率为!<<Q，表现典型的与自然发病一致的症状。经细菌学鉴定，"#797!菌与"#79菌的生物学特性一致，为同一种菌。

表8

$#%&8

"#79菌株感染常见海水养殖鱼类的实验

$’((6)(3,2(/415,/5(-4,/D2#3,/(5,+’(+W,4’"#79+43#,/

注射剂量死亡数实验数死亡率

（!<个2N D）鱼类鲑点石斑鱼青石斑鱼真鲷平鲷黑鲷红鳍笛鲷黄斑蓝子鱼

对照

!&;9&M8&89&M9&M8&;9&M

无菌GVJ

CCLL9L9<

CCCCCCCC

!<<!<<:<:<K<:<K<<

（8）溶藻弧菌是沿海地区食物中毒和散在性腹泻的重要病原菌，广泛存在于世界各地海水和海产

［L］品中，其数量居海水类弧菌之首。早在!;M9年，

主要是引起肠V,#X(就证实该菌对人类有致病作用，

道外感染。同时许多学者曾报道溶藻弧菌也是许多水产动物的致病菌，特别是海水养殖品种，如中国对、日本对虾（!Y*$+,#)’%&）、鲈虾（!"#$"%&’()#"#&)&）鱼、尖吻鲈、真鲷、台湾地区的石斑鱼（-+)#"+(".%&、赤点石斑鱼（-Y$2$$1$）、黑鲷（3+$1%&/$.$0$1)’%&）

，鲻鱼（5%6).’"+($.%&），大菱鲆$%1$4$）

（3’,+(4($./%&/$7)/%&），双壳贝类（0)8$.8"

［］，溶藻弧/,..%&’&）1,4)9"1:1$’(),#%&+.)’$4).)&等C>:。

9讨论

（!）从患病鲑点石斑鱼的不同组织分离到多株细菌，从中筛选M株细菌（"#7!至"#7M）进行鉴

定。用细菌学鉴定方法和自动鉴定系统（"R$ST7UEJ7K<）及半自动微生物鉴定系统（U$V）测定，并与标准菌株的生物学特性作对照，确定为溶藻弧

菌作为鲑点石斑鱼（-+)#"+(".%&9$1),）的致病菌的

第%期黄志坚等：鲑点石斑鱼细菌病原的分离鉴定和致病性]"

报道较少，本研究从患病鲑点石斑鱼分离病原菌，研究对小鼠和鲑点石斑鱼的毒力和致病性，同时比较研究对常见海水养殖鱼类的致病性，经鉴定为溶藻弧菌。进一步证实了溶藻弧菌的确是鲑点石斑鱼的病原菌。

（!）以溶藻弧菌攻毒小鼠和用不同方式感染鲑点石斑鱼及其它"种海水鱼类，溶藻弧菌不同菌株对小鼠有着不同程度的较强毒力，存在着菌株间的差异，腹腔注射感染小鼠的#$%&为!’()*&个+,#。选择强毒菌株-./!以不同感染方式感染鲑点石斑鱼表现不同的致病力，皮下注射感染鲑点石斑鱼的回接感染证实溶藻弧菌是鲑#$%&为(’*)*&"个+,#，

点石斑鱼细菌病的主要病原。同时溶藻弧菌-.0!菌株对不同海水鱼类也表现较强的致病性，体现了溶藻弧菌感染宿主的广泛性，这与有关学者的报道

［%01］一致，证实了溶藻弧菌是主要海水养殖鱼类细

%

参考文献：

［*］中科院微生物研究所细菌分类组3一般细菌常用鉴定

方法［4］农业出版社，3北京：*15"3

［(］6789:;7，<=#>?:3@ABCADEF,.GGH.IJKFDFLA,.LMNO.N/

［4］LABMJIJCD3@.ILM,JBA：PMIIM.,F.GQPMIRMGF，*1523［!］<=#>?:，6789:;:，S;9T><U<T，AL.I3@ABCADEF

［4］,.GGH.IJKQALAB,MG.LMVAO.NLABMJIJCD31LWAQ3@.ILM/,JBA：PMIIM.,F.GQPMIRMGF，*1123

［2］林业杰，陈亢川，陈拱立，等3溶藻弧菌噬菌体的分离

［?］（2）：3微生物学报，*11!，!!(5%0(513

［%］TXS>8;@，S>=@84，7=@97>S=;UTP，AL.I3-MOBMJ

.ICMGJIDLMNHF：LWAN.HFAJKCMIIQMFA.FAIA.QMGCLJYBJCBAFFMVAIJZ0IAVAI,JBL.IMLMAF.,JGC[HVAGMIALHBOJL，!"#$%&%’()*+［?］)’,-)*+#’MG.!"#&&-+%’.*’/-*)3?\MFW$MF，*11!，*]：(""0(5&3［]］

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［?］IA,FJKYB.ZGFMGBANMBHI.LMJGFDFLA,FMGLWAX63T_H.N/HILHBA，*1"]，"：(&*0(*"3

［5］#99663U.LWJCAGAFMFFLHQMAFJG0-1/-#’(2-3#(4&-"*+MGLWA

［?］CBJHYAB，5$-36$%6(*+)’(’1’/-"*+@IJNWALSNWGAMQAB34MNBJOU.LWJC，*11%，*1：!10253

［1］何建国，林蠡，黄志坚3海水鱼类溶藻弧菌致病性的初

步研究［?］（自然科学版），（增3华南师范大学学报*115刊）：%!0%%3

菌性疾病的主要病原体。

（2）在溶藻弧菌以不同方式感染鲑点石斑鱼的试验中，以肌肉感染方式的致病力最强，其他方式表现一定的致病力。在自然发病的鲑点石斑鱼中，病鱼多以背部肌肉溃烂，烂尾，胸鳍腹鳍基部出血，眼球突出，混浊，腹部膨胀，有腹水，肝脏灰白，肾脏充血为典型症状，这说明病原菌是在鱼体体质下降或鱼体受伤或相关病原的协同作用下，侵入鱼体，导致疾病的发生。关于溶藻弧菌的致病性及致病因子的研究，有待深入研究，以有效预防和控制暴发性疾病的流行。

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