细胞凝集反应

山东大学 生命科学 细胞实验

细胞凝集反应

【实验目的】

了解细胞膜的表面结构；

掌握凝集素促使细胞凝集的原理；

学习研究细胞凝集反应的方法。

【实验原理】

1.凝集素是一类含糖（少数除外）并能与糖专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。目前已发现近千种植物中含有凝集素，在各种真菌、无脊椎动物、脊椎动物、人体的各种组织和器官中及某些病原体内也含有凝集素。常用的为植物凝集素（PNA），通常以其被提取的植物命名，如半刀豆凝集素A、麦胚凝集素、花生凝集素和大豆凝集素等，凝集素是它们的总称。

在细胞表面，组成细胞膜的糖脂和糖蛋白伸出寡糖链，形成细胞外被。凝集素能与胞外被中的糖分子连接，在细胞间形成“桥”，从而引起细胞凝集。凝集素引起的血细胞凝集，其细胞膜结构没有发生变化，与血液凝固中发生的复杂生物化学过程完全不同；另外，凝集素能与不同的糖蛋白特异结合，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集，但是凝集素不是来源或参与免疫反应的产物，因此，Ponder提出应称“凝集素组织化学”而不能称为“凝集素免疫组织化学”。

人们利用凝集素与不同的糖蛋白特异性结合的原理，别和研究不同类型膜结构的生物学特征，以及进行血型鉴定。ABO血型鉴定主要用于临床输血，在皮肤、肾等器官移植的时候选择ABO血型相符的供体；不孕症和新生儿溶血症病因的分析及亲子鉴定等。另外，凝集素在临床疾病防治、机体生理活动调控以及生物工程等方面展示出了十分广阔的应用前景。植物凝集素可抑制受精；凝集素可直接抑制HIV-1反转录酶的活性，减少HIV感染者的病毒载量；细胞膜表面糖复合物的糖链结构与肿瘤细胞增殖、侵染、转移等发展过程密切相关，凝集素芯片技术实现了对癌症的快速、高通量检测，有助于筛选出癌症相关的糖链标志物。

2.细胞凝集

细胞凝集是指细胞彼此聚集在一起，成为一簇不规则的细胞团。细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。目前认为，细胞间的联系，细胞的生长和分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关。凝集素是一类含糖的（少数例外）并能与糖专一结合的蛋白质，如植物血球凝集素，伴刀豆凝集素和土豆凝集素等，它具有凝集细胞核刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。

3.细胞凝集的反应技术

一、直接凝集反应技术

颗粒性抗原（菌、螺旋体、红细胞等）与相应的抗体血清混合后，在电解质的参与下，经过一定时间，抗原抗体凝聚成肉眼可见的凝集块，这种现象称为凝集反应。血清中的抗体称为凝集素。抗原称为凝集原。细菌或其他凝集原都带有相同的电荷（阴电荷），在悬液中相互排斥而呈均匀的分散状态。抗原与抗体相遇后，由于抗原和抗体分子表面存在着相互对应的化学基团，因而发生特异性结合，称为抗原抗体复合物。由于抗体与抗原结合，降低了抗原分子间的静电排斥力，抗原表面的亲水基团减少，由亲水状态变为疏水状态，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于例子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之是去了彼此间的经典排斥力，分间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒。出现了肉眼可见的凝集反应。但是，直接凝集反应技术也有缺点：特异性不高、抗原抗体无法获得或无法用于实验。

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二、间接凝集反应技术

可溶性抗原（或抗体）吸附于免疫学反应无关的颗粒（称为载体）表面上，当这些致敏的颗粒与相应的抗体（或抗原）相遇时，就会产生特异性的结合，在电解质参与下，这些颗粒就会发生凝集现象。这种借助于载体的抗原抗体凝集现象就叫做间接凝集反应。载体的存在使反应的敏感性得以大大提高。

间接凝集反应的优点：

（1）敏感性强：间接凝集反应是最敏感型的血清学反应方法之一，可以检测到微量的抗体和抗原；

（2）快速：一般1h-2h即可判定结果，若在玻板上进行，则只需几分钟；

（3）特异性强；

（4）使用方便、简单

三、载体

具有吸附抗原（或抗体）的载体很多，如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物的红血球、某些细菌等。

良好的载体有以下几点基本要求：

（1）在生理盐水或缓冲液无自凝倾向；

（2）大小均匀；

（3）比重与介质相似，短时间内不能沉淀；

（4）无化学或血清学活性

（5）吸附抗原（或抗体）后，不影响其活性。

目前应用最广的是人的O型红血球和绵羊红血球。而后者应用更广，因为其来源方便。另外绵羊红血球的表面有大量的（约1000个以上）糖蛋白受体，极易吸附某些抗原物质，吸附性能好，且大小均匀一致。

【实验用品】

1.材料

土豆块茎、家兔

2.试剂

（1）PBS缓冲液

称取氯化钠7.2g、磷酸氢二钠1.48g、磷酸二氢钾0.43g，加蒸馏水，定容至1L，调pH至

7.2。

（2）1%肝素溶液

0.1g肝素溶解于10mL0.9%氯化钠溶液中。

3.器材

5mL注射器、酒精棉球、双凹片、载玻片、普通光学显微镜、托盘天平、滴管、离心管。

【实验步骤】

1.取土豆去皮块茎2克，切碎并加10mlPBS缓冲液，浸泡24小时，浸出的粗体液中即含有可溶性土豆凝集素；

2.用针管抽取一定体积的抗凝剂（1%肝素溶液），并使抗凝剂充分浸润针管各部以及针头。然后从兔子耳根处或心脏抽取兔子静脉血1ml，加生理盐水3ml，在1000r/min条件下，离心5分钟。重复三次离心，最后按沉淀的红细胞体积用生理盐水配成1%的红细胞悬液；

3.在双凹片的左孔滴加一滴PBS缓冲液，同时在双凹片的右孔处滴加一滴土豆凝集素；

4.在双凹片的左右孔同时滴加一滴1%的红细胞悬液，然后使左右孔内的液体都充分混匀；

5.左手捏住双凹片的一端，右手轻轻摇晃双凹片，使凹槽内的液体充分的混合，如此摇晃5～10分钟，观察结果；

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6.先以白纸为衬托，直接观察双凹片凹槽内混合样品发生凝集的现象，注意左右凹槽内不同现象的对比，对于发生凝集的一边注意观察凝集与不发生凝集的区别。直接观察后在光学显微镜下观察两凹槽内现象的区别，并用照相机拍摄实验结果。

【实验结果】

1. 实验现象记录及实验结果分析

左孔中的红细胞在震荡过程中，红细胞不断向中间靠拢，最终形成中间颜色较深，边缘颜色较浅的红细胞混浊溶液。液体干了以后并未见粉末状颗粒。

右孔中的红细胞在震荡过程中，溶液中红细胞集，溶液由混浊变澄清，并随着震荡的进行，凝集的血块逐渐聚拢，最后在液滴中形成若干细小血块。液体干了以后呈粉末状。 土豆凝集素可使血液发生凝集，PBS试剂不能使血液发生凝集。

2. 实验前后的宏观效果对比

凝集前

凝集中

凝集完成

开始时，由于二者还没有充分混合，加入PBS缓冲液和加入土豆凝集素的两滴细胞悬液差异不大，此时还未发生细胞凝集作用。

当充分摇匀后，两者对比已经比较明显，其中加入土豆凝集素的细胞悬液发生了细胞凝集现象，红细胞凝集在一起，呈颗粒状，周围的悬液较澄清，而只加入PBS缓冲液的未发生凝集作用，从整体上来看形成的仍为均匀的胶状液体，期间可能出现聚集，但稍微摇晃便可散开。

3．显微镜下微观效果对比

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未凝集的红细胞松散的排列

凝集的红细胞聚集成团状

【实验结果分析与注意事项】

1.把液体滴加到双凹片上时，注意用量，防止悬液过多而溢出，使两个细胞悬液接触，导致实验结果不可靠。

2. 滴加1%的红细胞悬液时，可适当的多加点儿，便于实验结果的观察。

3. 用手晃动双凹片时，注意摇晃的姿势：一只手用手掌处贴紧双凹片，另一只手抵住双凹片的另一侧上下晃动。

4. 摇晃的时间可适当延长，提高红细胞凝集程度。

5. 浸出土豆凝集素时选发芽的或发青色的土豆。由此可知发芽土豆不宜食用，因其所含土豆凝集素可让血细胞发生凝集。

6. 区分血清与血浆，血清指血液自然沉降后所得上清液，而血浆是血液加抗凝剂后离心所得上清液。

7. 凝血是指多个细胞聚集成不规则细胞簇，溶血是红细胞在低渗溶液作用下，肿胀破裂放出血红蛋白的过程。土豆凝集素中：很多红细胞凝集在一起，形成了若干块凝集产物，颜色较深。

【实验思考】

结合凝集素的特性，简述凝集素在生物学中有何应用？研究凝集素有何意义？

人们利用凝集素与不同的糖蛋白特异性结合的原理，识别和研究不同类型膜结构的生物学特征，以及进行血型鉴定。ABO血型鉴定主要用于临床输血，在皮肤、肾等器官移植的时候选择ABO血型相符的供体；不孕症和新生儿溶血症病因的分析及亲子鉴定等。另外，凝集素在临床疾病防治、机体生理活动调控以及生物工程等方面展示出了十分广阔的应用前景。如：植物凝集素可抑制受精；芸豆凝集素可直接抑制HIV-1反转录酶的活性，减少HIV感染者的病毒载量；细胞膜表面糖复合物的糖链结构与肿瘤细胞增殖、侵染、转移等发展过程密切相关，凝集素芯片技术实现了对癌症的快速、高通量检测，有助于筛选出癌症相关的糖链标志物。