细胞凋亡研究进展_李超

第29卷第3期

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2007年6月45-53页

世界科技研究与发展

WORLDSCI??TECHR&D

Vo.l29No.3

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Jun.2007pp.45-53

细胞凋亡研究进展

李??超??伏圣博??刘华玲??马欣荣

1

1

2

2*

(1.四川大学生命科学学院,成都610064;2.中国科学院成都生物研究所,成都610041)

摘??要:细胞凋亡(apoptosis)是机体正常细胞在受到生理和病理性刺激后出现的一种自发的死亡过程,是一个主动、高度有序、基因控制及一系列酶参与的过程。细胞凋亡在保证多细胞生物健康生存过程中扮演着关键角色,对个体的正常发育具有重要作用。它在多细胞生物的组织分化、器官发育、机体稳态的维持中有着重要的意义。机体在产生新生细胞的同时,衰老和突变的细胞通过凋亡机制而被清除,使器官和组织得以正常地发育和代谢。细胞凋亡发生异常会导致疾病的发生,如肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染和神经退化性疾病等。由于细胞凋亡的重要意义,它在生物进化过程中不但得到了保留,而且从简单的多细胞生物线虫,到高度进化的人类,细胞凋亡机制随着生物的进化得到了发展和完善。本文概述了细胞凋亡的特征、分子机制、信号途径、检测方法及生物学意义。关键词:细胞凋亡Caspase??Bcl-2??调亡途径??检测方法??生物学功能

ResearchAdvancesonApoptosis

LIChao??FUShengbo??LIUHualing??MAXinrong2.ChengduInstituteofBiology,CAS,Chengdu610041)

Abstract:Apoptosisisaspontaneouscell-suicideprocesstriggeredinresponsetophysiologicalandpathologicalstress

stimul.iItisaninitiative,tightlyregulatedandgenecontrolledprocessinvolvedintheparticipationofaseriesofenzymes.Apoptosisplaysakeyroleinthetissuedifferentiation,organdevelopmentandindividualhomeostasisinmulticellularorgan??ismsbyeliminatingredundant,damagedorinfectedcells.Apoptosisisassociatedwithdiseases.Derangementofapoptosisresultsindiseasessuchascancer,auto-immunity,viralinfectionsandneurodegenerativedisease.Apoptosisexistsubiq??uitouslyinmulticellularorganismsandevolvesintohighly??oderedprocess.Thisreviewfocusedonthecharacteristics,mo??lecularmechanisms,detectionmethods,signalpathways,andbiologicalsignificanceofapoptosis.Keywords:apoptosis,caspase,Bcl-2,apoptoticpathways,detectionmethods,biologicalsignificance

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(1.SchoolofLifeScience,SichuanUniversity,Chengdu610064;

引言

细胞凋亡(apoptosis)是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡,最早是1972年由Kerr教授根据形态学特征首先提出的

[1]

死亡(programmedcelldeath,PCD)

[2]

。在凋亡和

PCD中均涉及了??程序性??的概念。而事实上,两者的含义是不同的,最初提出的程序性细胞死亡,是描述发生于各生物种系胚胎发育过程中正常细胞死亡的所有表型,具高度可遗传的时序性和空间性,即细胞在发育的特定阶段按序死亡。细胞凋亡时间到来时,需要另一种程序来提供细胞死亡的武器以控制细胞发生主动的??自杀??过程,这种??手段程序??便是细胞凋亡中??程序性??的含义。

另外,在形态学方面,细胞凋亡与PCD也存在着差异。在发育过程中许多明显的程序性死亡并未显示出凋亡中诸如细胞浓缩、染色质聚集、核酸内切酶活化、凋亡小体等特征。因此,有学者认为PCD是一种没有核酸内切酶诱导的DNA梯形带的出现,并常伴有自噬溶酶体活性升高的细胞发育死亡过

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。细

胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用。它并不是病理条件下,自体损伤的一种现象,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞发生凋亡时,就像树叶或花的自然凋落一样,该过程普遍存在于动物和植物中。

长期以来,细胞凋亡往往又被称为程序性细胞

*通讯作者:马欣荣,Te:l028-85252387;E-mai:lmaxr@http://wendang.chazidian.com

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[7,8]

程。严格地说,凋亡是一形态学概念,是对多种从而使tTG活化。

方式引起的一种特征性形态和生化改变的概括。它并非代表引起细胞死亡的过程和路径,而是指众多因素造成的众多死亡途径的最终表现。

细胞凋亡和细胞坏死(necrosis)是两种截然不同的细胞学现象。如前所述,细胞凋亡是一种主动的由基因决定的细胞自我破坏的过程,而细胞坏死则是极端的物理、化学因素或严重的病理性刺激引起的细胞损伤和死亡。二者是不同的生理过程。

细胞凋亡整个过程中,细胞膜的整合性保持良好,凋亡细胞胞膜成分与结构的改变可以被吞噬细胞表面的粘附分子及磷酯酰丝氨酸受体所识别,凋亡小体为邻近的细胞所吞噬而降解,死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中去,所以凋亡的细胞不引起局部炎症反应,也不引起周围组织的损伤。相反,在细胞坏死时,细胞膜发生渗漏,细胞内容物,包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片断,释放到胞外,导致炎症反应。表1为细胞凋亡和细胞坏死的主要区别

[9]

1??细胞凋亡特征

细胞凋亡的发生过程,在形态学上可分为三个阶段:??凋亡的起始。这一阶段的形态学变化表现为细胞表面的特化结构如微绒毛的消失,细胞间接触的消失,但细胞膜仍然完整,未失去选择透性;细胞质中,线粒体大体完整,但核糖体逐渐从内质网上脱离,内质网囊腔膨胀,并逐渐与质膜融合;染色体固缩,形成新月形帽状结构等形态,沿着核膜分布。这一阶段经历数分钟,然后进入第二阶段。??凋亡小体形成。首先,核染色质断裂为大小不等的片断,与某些细胞器如线粒体一起聚集,为反折的细胞膜所包围。从外观上看,细胞表面产生了许多泡状或芽泡状突起。以后,逐渐分隔,形成单个的凋亡小体

[4]

。

表1??细胞凋亡与细胞坏死比较

Table1??Thecomparisonsbetweenapoptosisandnecrosis

特征诱导因素细胞数量膜完整性染色质细胞核细胞器胞内容物细胞形状基因组DNA大分子合成基因调控后果意义

细胞凋亡生理及弱刺激单个细胞丢失保持到晚期凝集呈半月状早期固缩断裂无明显变化无释放

形成凋亡小体有控降解一般需要有

不引起炎症反应生理死亡方式

细胞坏死强烈刺激

成群细胞死亡早期即丧失稀疏呈网状晚期破碎肿胀、坏死释放

破裂成碎片随机降解不需要无

引起炎症反应病理死亡方式

。??凋亡小体逐渐为邻近的细胞所吞噬并消

[5]

化。从细胞凋亡开始,到凋亡小体的出现才数分钟,而整个细胞凋亡过程可能延续数小时

。

在Caspase家族半胱氨酸蛋白酶在凋亡中的关键作用发现以前,人们所认识到的细胞凋亡的最主要特征是DNA发生核小体间的断裂,结果产生含有不同数量核小体单位的片段,在进行琼脂糖凝胶电泳时,形成了特征性的梯状条带(DNAladders)

[6]

,

其大小为180~200bp的整数倍。到目前为止,梯状条带仍然是鉴定细胞凋亡最可靠的方法。催化DNA降解的是依赖于CaZn则抑制其活性。

凋亡细胞的另一个重要特征是组织转谷氨酰胺酶(tissuetransglutaminase,tTG)的积累并达到较高的水平。tTG催化某些蛋白质翻译后的修饰,主要是通过建立谷氨酰胺和赖氨酸之间的交联以及多胺掺入蛋白质而实现的,其结果导致蛋白质聚合。这类蛋白聚合物不溶于水,不为溶酶体的酶所降解,它们进入凋亡小体,有助于保持凋亡小体暂时的完整性,防止有害物质的逸出。tTG只在不再分裂的、已完成分化的细胞中处于活性状态。tTG是依赖于Ca的酶,在生活正常的细胞中,由于Ca浓度较低,tTG的活性很低;当凋亡起始时,Ca浓度上升,

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2+

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/Mg的核酸内切酶,而

2+

细胞凋亡是一个主动的、信号依赖的过程,可以由许多因素所诱导,如放射线照射、毒素、药物、缺血缺氧、病毒感染等。诱导因子大致可分为物理性诱导因子包括射线(如紫外线,??射线等)、较温和的温度刺激(如热激、冷激)等和化学及生物诱导因子包括活性氧基团和分子、钙离子载体、视黄酸、细胞毒素、DNA和蛋白质合成的抑制剂、正常生理因子的失调,肿瘤坏死因子等。

研究发现,这些因素大多可以通过激活死亡受体而触发细胞凋亡机制。死亡受体是近年发现的一组细胞表面蛋白,属于肿瘤坏死因子受体超家族,它们与相应的配体结合后,可以通过一系列的信号转导过程,将凋亡信号向细胞内部传递。这个过程涉及到多个家族的蛋白质,包括TNF/TNFR超家族、

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TRAF超家族、死亡结构域蛋白质等,最终引起细胞凋亡的执行者Caspase蛋白酶家族的活化,这些蛋白酶剪切相应的底物,使细胞发生凋亡。

孔道。Bax能允许一些离子和小分子如细胞色素c(cytochromec)等穿过线粒体膜,进入细胞质,从而引起细胞凋亡;而Bcl-2的作用正好相反,它能封闭Bax形成孔道的活性,使一些小分子不能自由通透,从而保护细胞免于凋亡。??Bcl-2能将凋亡蛋白前体Apaf-1(apoptoticproteaseactivatingfactor-1)等定位至线粒体膜上,使其不能发挥凋亡作用

[11]

2??细胞凋亡的分子机理

和细胞增殖一样,细胞凋亡也是受基因调控的精确过程,其途径主要有两条,一条是通过细胞膜上的死亡受体激活半胱氨酸蛋白酶Caspase,另一条是通过胞质内的线粒体途径释放细胞凋亡因子激活半胱氨酸蛋白酶Caspase。这些活化的Caspase可将细胞内的重要蛋白降解,引起细胞凋亡。其中研究较多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、C-myc、p53、ATM等。与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基都参与对细胞凋亡的凋控,本文主要探讨了Bcl-2、C-myc、p53、Caspase、Fas/APO-1等的功能。2.1??Bcl-2基因家族

Bcl-2基因,最先在B-cellleukemia中发现,由此命名。在细胞凋亡过程中,Bcl-2蛋白家族成员起着至关重要的作用。它们具有较高的同源性,而且还有BH1(Bcl-2homologydomain1)、BH2、BH3、BH4等保守结构域。

Bcl-2家族可以分为两大类:一是抗凋亡的,主要有Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1(myeloidcellleukemia-1)、CED9等;二是促细胞死亡的,主要包括Bax、Bak、Bcl-XS、Bad、Bik、Bid等。Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1等是细胞死亡的负调因子,在许多类型的细胞受到外界刺激时能保护细胞免于凋亡

[10]

。

c-myc属于原癌基因,对细胞具有两方面的

2.2??C-myc与细胞凋亡

作用,既可参与细胞的增生转化,又可诱导或促进细胞凋亡的发生,是一种早期快反应基因。它的表达可以使细胞从G0期过渡到G1期,细胞周期变短,分裂加速

[12]

。而在细胞分化时,c-myc表达降低,细

胞生长受到抑制。c-myc可以诱导成纤维细胞、杂交瘤T细胞、白血病细胞等发生凋亡,且这种作用可因Bcl-2或突变型p53的表达而被抑制2.3??抑癌基因p53

抑癌基因p53编码产物与肿瘤的发生、发展相关,为肿瘤抑制基因。p53可分为两种类型,一种是可诱导细胞发生凋亡的野生型,另一种是具有抑制凋亡能力的突变型。野生型p53是作为细胞周期G1的控制蛋白而发挥作用的

[14]

[13]

。

,当DNA损伤时,

p53编码的转录活化蛋白聚集在DNA损伤部位,使DNA受损细胞停止在G1期,阻止DNA复制,从而使DNA得到修复,若DNA受损细胞修复失败,则p53介导细胞凋亡。如果DNA受损细胞逃脱了p53的监控,细胞就在遗传物质变异的基础上不断增殖而癌变。

2.4??Caspase蛋白酶家族

Caspase蛋白酶参与Fas诱导的细胞凋亡,与线虫细胞凋亡基因Ced-3同源,能选择性降解蛋白质。Ced-4在哺乳动物中的同源体为Apaf-1,能激活Caspase-3,这一过程需要细胞色素c(Apaf-2)和Apaf-3的参与

[15]

。

它们主要定位在核膜的胞质面、内质网及线粒体外膜上,与膜的结合对于其发挥功能是极其重要的。

线粒体膜上的Bcl-2至少在三个水平上发挥功能来抑制凋亡:??Bcl-2能改变线粒体巯基的氧化还原状态来控制其膜电位从而调控细胞凋亡。在细胞凋亡中,线粒体的巯基可能组成了胞内氧化还原电位的传感器,Bcl-2可能是通过抑制谷胱甘肽(GSH)的外泄,降低胞内的氧化还原电位,来抑制细胞凋亡的。??Bcl-2能调节粒体膜对一些凋亡蛋白前体的通透性。Bcl-2蛋白可能是线粒体PT孔道的组成成份,它在较高pH的条件下能形成离子通道,而Bax则能在较为广泛的pH范围内形成

。

Caspase属于半胱氨酸蛋白酶,这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶,一旦被信号途径激活,能将细胞内的蛋白质降解,使细胞不可逆地走向死亡。它们均有以下特点:??酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性;??总是在天冬氨酸之后切断底物,所以命名为Caspase(cysteineaspartate-specificprotease),方

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便起见本文称之为凋亡酶;??都是由两大、两小亚基组成的异四聚体,大、小亚基由同一基因编码,前体被切割后产生两个活性亚基。

最早发现人类中与线虫ced-3同源的基因是ICE,因该酶能将白介素前体切割为活性分子,故名。通过cDNA杂交和查找基因组数据库,在人类细胞中已发现11个ICE同源物,分为2个亚族(subgroup):ICE亚族和CED-3家族,前者参与炎症反应,后者参与细胞凋亡;又分为两类:一类为执行者(executioner或effector),如caspase-3、6、7,它们可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白,引起凋亡,但不能通过自催化(autocatalytic)或自剪接的方式激活;另一类为启动者(initiator),如caspase-8、9,受到信号后,能通过自剪接而激活,然后引起caspase级联反应,如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7

[16]

的活性,但目前还未发现在哺乳动物中发现p35和CrmA的同源分子。

FLIPs(FLICE-imhibiroryproterins)能抑制Fas/TNFR1介导的细胞凋亡

[20]

。它有多种变异体,但N

-端功能前区完全相同,C端长短不一。FLIPs通过DED功能区,与FADD和Caspase-8,10结合,拮抗它们之间的相互作用,从而抑制Caspase8,10募集到死亡受体复合体和它们的起始化。

3??细胞凋亡途径

3.1??细胞膜上的死亡受体途径

细胞凋亡的膜受体通路:各种外界因素是细胞凋亡的启动因子,它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号,引起细胞凋亡,以Fas-FasL为例说明。

Fas是一种跨膜蛋白,属于肿瘤坏死因子受体超家族成员,它与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤:首先配体诱导受体三聚体化,然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物,这个复合物中包括带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD

[21]

。

细胞中还具有caspase的抑制因子,称为IAPs(inhibitorsofapoptosisproteins),属于一个庞大的蛋白家族。它们能通过BIR结构域(baculovirusIAPrepeatsdomain)与caspase结合,抑制其活性,如XI??AP

[17]

。

。Fas又称CD95,是由325个

2.5??Fas与细胞凋亡

Fas(又称APO-1或CD95),与Bcl-2基因是凋亡相关基因中作用相反的两个典型代表。其为TNFR家族成员,基因产物为一跨膜糖蛋白。与其配体FasL或Fas抗体结合后,经特殊胞内蛋白介导,直接激活凋亡基因产物,诱导Fas蛋白所在的细胞凋亡。有研究表明,某些细胞在发生、发展过程中,Fas基因的表达不断加强,而凋亡抑制基因Bcl-2的表达逐渐减少,最终导致细胞凋亡的发生,完成细胞代谢过程,达到细胞增殖与凋亡的平衡2.6??凋亡抑制分子

迄今为止,已发现多种凋亡抑制分子,包括p35、CrmA、IAPs、FLIPs、Bcl-2家族。p35和CrmA是广谱凋亡抑制剂,是由病毒基因所编码的蛋白质。p35来自于杆状病毒,CrmA来自牛痘病毒。体外研究结果表明p35以竞争性结合方式与靶分子形成稳定的具有空间位阻效应的复合体并且抑制Caspase活性

[19]

[18]

氨基酸组成的受体分子,Fas一旦和配体FasL结合,可通过Fas分子启动致死性信号转导,最终引起细胞一系列特征性变化,使细胞死亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子,可出现于多种细胞表面,但FasL的表达却有其特点,通常只出现于活化的T细胞和NK细胞,因而已被活化的杀伤性免疫细胞往往能够最有效地以凋亡途径置靶细胞于死地

[22]

。

Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域(DD,deathdomain)。三聚化的Fas和FasL结合后,使三个Fas分子的死亡结构域相聚成簇,吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白,它由两部分组成:C端(DD结构域)和N端(DED)部分。DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合,该蛋白再以DED连接另一个带有DED的后续成分,由此引起N段DED随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶8(caspase-8)酶原发生同嗜性交联,聚合多个Caspase-8的分子,Caspase-8分子逐由单链酶原转成有活性的双链蛋白,进而引起随后的级联反应(cascade),即后者作为酶原而被前者激活,引起下

。

。同时被靶Caspase特异切割后的p35与

Caspase的结合更强,CrmA(CytokineresponsemodferA)是血清蛋白酶抑制剂,能够直接抑制多种蛋白酶

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面的级联反应,细胞发生凋亡。因而TNF诱导的细胞凋亡途径与此类似

[23,24]

线粒体PT孔(permeabilitytransitionpore)主要由位于内膜的腺苷转位因子(adeninenucleotidetranslocator,ANT)

[33]

。

3.2??内质网的凋亡信号途径

内质网功能的有效发挥,是保证细胞活动和生存的关键。当内质网处于被干扰的状态下,未能折叠的蛋白质将会在其区域聚集。内质网膜上的受体一旦探测到了施加于内质网的干扰,将会起始非折叠蛋白反应(UPR),以保证内质网的正常生理功能。如果这种干扰一直继续,而应急反应没有发挥作用,那么细胞就会启动凋亡程序

[25]

和位于外膜的电压依赖性阴离

[34]

子通道(voltagedependentanionchanne,lVDAC)

等蛋白所组成,PT孔开放会引起线粒体跨膜电位下降和细胞色素c释放。Bcl-2家族蛋白对于PT孔的开放和关闭起关键的调节作用,促凋亡蛋白Bax等可以通过与ANT或VDAC的结合介导PT孔的开放,而抗凋亡类蛋白如Bcl-2、Bcl-xL等则可通过与Bax竞争性地与ANT结合,或者直接阻止Bax与ANT、VDAC的结合来发挥其抗凋亡效应。

Bcl-2家族的结构和能形成离子通道的一些毒素(如大肠杆菌毒素)非常相似。插入膜结构中形成较大的通道,允许细胞色素c等蛋白质通过,这可能是细胞色素c释放的另一个途径。

上述三条信号途径,最终都是集中到线粒体来执行凋亡过程。现在一般认为细胞凋亡的途径仍然主要有两条,即胞膜上的死亡受体途径和胞质内的线粒体途径,而内质网的凋亡信号途径往往归并于线粒体途径。线粒体在细胞凋亡中的核心地位如图1所示。

3.4??两种最新发现的凋亡形式

在诱导细胞凋亡或者细胞程序性死亡的诸多因素中,细胞间质是被研究最多的对象。而与细胞连接有关的细胞凋亡被称之为??失巢凋亡??(anoikis)

[35]

。内质网的凋

亡信号途径主要是通过内质网内释放的蛋白质分子与Caspase蛋白家族中的Caspase-8以及其他蛋白如Bap31、IRE1等组合成蛋白质复合物,作用于Bcl-2家族中的Bid、Bim,进而作用于线粒体,进入线粒体通路的细胞凋亡信号途径3.3??线粒体的凋亡信号

线粒体是细胞生命活动控制中心,它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心,而且是细胞凋亡调控中心。研究表明了细胞色素c从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素c在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1(Apaf-1)结合,使其形成多聚体活

[29~31]

[27,28]

[26]

。

,并促使Caspase-9与

[32]

其结合形成凋亡体(apoptosome),Caspase-9被激

。被激活的Caspase-9

能激活其它的

Caspase如Caspase-3等,从而诱导细胞凋亡。此外,线粒体还释放凋亡诱导因子,如AIF,参与激活Caspase。可见,细胞凋亡体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。促凋亡因子能诱导细胞色素c释放和凋亡体的形成。很显然,细胞色素c从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的关键问题。多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途经也有细胞色素c从线粒体的释放作为凋亡诱导因子,细胞色素c能与Apaf-1、Caspase-9前体、ATP/dATP形成凋亡体,然后召集并激活Caspase-3,进而引发Caspases级联反应,导致细胞凋亡。在这里,一个核心的问题是细胞色素c究竟通过哪一种途径释放到细胞质中,由于大部分凋亡细胞中很少发生线粒体肿胀和线粒体外膜破裂的现象,所以目前普遍认为细胞色素是通过线粒体PT孔或Bcl-2家族成员形成的线粒体跨膜通道释放到细胞质中的。

,其中失巢的意思即是指细胞间失去了

粘着。而失巢凋亡的起始,通常都是从抗粘着的物质开始的。此通路中所涉及到的关键酶有EGF,EGFR,ERK,JNKs等,其发挥作用最终也要通过Bcl-2蛋白家族和线粒体

[36]

。

Asher等人首次提出了副凋亡(para-apopto??sis)的概念,其典型特征是由线粒体和内质网肿胀造成的胞浆空泡化

[37]

。与坏死不同的是,副凋亡并

不出现细胞膜的破坏。最近,Sperandi等人对一种非凋亡形式的程序性细胞死亡进行了深入研究,他们将其称为paraptosis

[38]

。与凋亡相比,副凋亡形式

的程序性细胞死亡有着截然不同的形态学特点。当细胞发生副凋亡时,细胞体积变大,电子显微镜下观察可见细胞内出现大量由线粒体和内质网肿胀形成的胞浆空泡。发生自噬性程序性细胞死亡的细胞在电镜下观察也可看到大量的胞浆空泡,但这种空泡

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