细胞色素C工业提取

上传者：艾军
|
上传时间：2015-04-26
|
密次下载

细胞色素C工业提取

细胞色素C制备

粗制提取：将新鲜或冷冻猪心洗去心血，绞碎。加入1.5倍量水，搅拌均匀，用1mol/L硫酸调整pH至4.0左右，于常温搅拌提取12h，压榨，滤液用2mol/L氨水调pH至6.0，充分静置沉淀。虹吸上清液，下层心渣离心甩干。合并清液，以2mol/L氨水调pH至7.5。

吸附：提取液用边疆式管状高速离心机（油水分离器）离心，清液缓缓通过人造沸石吸附柱（每L提取液约需80目沸石10g)。

洗涤：将吸附细丙的人造沸石倾出，用水搅拌洗涤3次，每次20min，继续用0.2%氯化钠溶液洗涤4次，再用水洗涤3次后，将人造沸石装柱。

洗脱：将25%硫酸铵溶液（比重1.15)缓缓加入吸附柱，控制流速使洗脱体积尽量少些。流出液变红时开始收集，至红色液尽即洗脱完毕。

盐析：洗脱液被加固体硫酸铵，搅拌溶解，使比重达1.24，10℃以下静置1h，过滤，滤液应澄明。

三氯醋酸沉淀，在搅拌下，分离出细丙沉淀。

透析：细丙沉淀用少量蒸馏水溶解，装入透析袋，对水透析至无硫酸根。

透析液过滤：得粗品溶液，加适量氯仿作防腐剂，置冰箱保存。

精制吸附：将预处理Amberlite IRC-50铵型树脂按需要量装入吸附柱（吸附1g细丙约需干树脂7g），将粗品去氯仿，缓缓恒速流入吸附柱，树脂呈酱红色，吸附完毕后再用少量蒸馏水洗。

洗涤：吸附完毕将树脂上部含较多蛋白部分的浅色层取出单独处理。其余树脂倾出，用水洗涤3次，将水倾出，手戴乳胶手套反复搓树脂，以除去吸附杂质，搓后用蒸馏水洗涤，干搓、水洗村脂3～4次，直至水澄明。以后再用蒸馏水搅拌洗涤15～20次（每次15min)。

洗脱：洗好的树脂装柱，用无热原蒸馏水冲洗15min，除去可能污染的热源。用新鲜配制的0.4mol/L氯化钠-60mmol/L磷酸氢二钠混合液进行洗脱，流出液变红时开始分段收集，颜色较浅的为前段；深红色的为中段；快结束时颜色变浅的为后段。

前段和后段含杂蛋白较多，透析后重新吸附精制，浅色层树脂经洗脱后也作为回收处理。

透析：中段洗脱液装袋对蒸馏水透析，每h换水1次。经常轻轻摇动透析袋，透析至无氯离子。透析液滤清，加适量氯仿，置2～5℃处保存。

精制过程应使用无热原蒸馏水，所用氯仿要用蒸馏水洗去其中的醇类。

细胞色素C （细胞色素丙， Cytochrome C)

细胞色素C是一种以铁卟啉为辅基的呼吸酶，是细胞呼吸激活剂，属于络合蛋白质。由多肽与血色素络合而成。血色素是铁的衍生物，具氧化还原的可逆性，从而导致细胞色素α能在生理氧化反应过程中表现出电子传导，即Fe2+→←Fe3+的效能，以促进细胞的氧化反应，达到兴奋呼吸目的。它在生物氧化过程中，是一个非常重要的电子传递体。马心是常用的提取原料。猪、牛、羊、兔心均含此酶，鲐鱼肉含0.0138%，鲐鱼心含0.0018%。鲨心及骆驼心均含有。

活性及应用

细胞色素C是有效的电子传递体，对因组织缺氧引起的一系列症状，起到矫正细胞呼吸与物质代谢作用。

临床上细胞色素C主要用于治疗因组织氧化还原过程障碍及因组织缺氧所引起的一系列疾病，如改善脑血管障碍、脑出血、脑外伤、脑动脉硬化、脑栓塞、中风后遗症等引起的氧缺乏诸症状；治疗一氧化碳中毒、催眠剂中毒、新生儿假死、视神经症以及因心脏代谢障碍、心绞痛引起的心肌组织缺氧等。也可应用细胞色素C治疗因支气管哮喘和慢性肺炎所致的肺功能不全。有报道对进行性肌肉萎缩症也显较好疗效。其肠溶衣口服片对放疗和化疗引起的白细胞降低等也有改善作用。

细胞色素C在一定条件下可以吸收、转运和进入靶细胞膜。氧化型细胞色素C对线粒体亲合力及心肌固着力均比还原型细胞色素C为好。两者氧化还原的情况也不相一致，在生物学效应方面还原型细胞色素C远不及氧化型细胞色素C。细丙具有催化O2-·的作用形成O2-·/O2循环，这很有实际意义，可考虑扩大临床应用于抗炎、抗衰老等方面。