SARS_CoVS蛋白抗原表位多肽的设计合成与免疫反应

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SARS_CoVS蛋白抗原表位多肽的设计合成与免疫反应

?40?文章编号:1008-9926(2005)01-0040-03　　中图分类号:R914.5　　文献标识码:A

SARS2CoVS蛋白抗原表位多肽的设计合成与免疫反应

张嘉杰②,吴少瑜,徐　伟,吴曙光

(中国人民解放军第一军医大学药物研究所　广东　广州　510515)

①

摘　要:目的　通过生物信息学与合成多肽方法,寻找SARS2CoVS蛋白的抗原表位,为抗SARS多肽疫苗的深入研究提供试验依据。方法　利用网络共享软件对与S蛋白抗原性相关的参数进行预测分析,从而设计S蛋白的抗原表位多肽;将合成的抗原表位多肽免疫家兔,用ELISA法检测产生的抗体。结果　ELISA法检测发现,设计合成的2个抗原表位多肽片段(残基3482

380,4342470)在家兔体内均能诱导抗体产生。结论　设计合成的2个抗原表位多肽片段中包含SARS2S蛋白的抗原表位,

免疫家兔后能产生特异性抗体。

关键词:SARS冠状病毒;S蛋白;抗原表位;多肽疫苗

DesignsynthesisandimmuereactionSARS2CoVspikeprotein

ZHANGJia2Jie,WUShao2Yu,XUWeiG(InstituteofPharmaceuticUniversity,Guangzhou　510515,Guangdong　China)ABSTRACTtheepitopesofSproteintodeveloppeptidevaccineagainstSARS2CoVinfection,wede2signedandepitopepeptidesofSproteinbycombineduseofbioinformaticalandstructuralanalysis.MethodsEpitopepeptidesofSproteinweredesignedandsynthesizedafterpredictingandanalyzingtherelationalparametersoftheantigenicityofSproteinwithonlinesharingsoftwareandrabbitswereimmunizedwiththesesyntheticpeptides.AntibodiesweretestedbyELISA.ResultsBothoftwosyntheticpeptides(aminoacidresidues3482380,4342470)elicitedspecificantibodies.ConclusionTowsyntheticpeptidescanelicitspecificantibodiesinrabbits,whichmayimplythattheycontaintheepitopesequencesofSproteinofSARS2CoV.

KEYWORDS:SARScoronavirus;Spikeprotein;Epitope;Peptidevaccine

　　严重急性呼吸道综合征(severeacuterespiratorysyndrome,SARS)是一种新型的强传染性和高死亡率疾病,其病原体为一种新的冠状病毒(SARSCoron2avirus,SARS2CoV)[1]。由于将冠状病毒制成的灭活疫苗或减毒疫苗在正常人体应用时存在潜在的危险性,而且对不同病毒株免疫性存在差异[2],因此从长远利益考虑,针对性强、安全性高的多肽疫苗成为了SARS疫苗研究的重点之一。研究抗SARS多肽疫苗的关键是从SARS冠状病毒的功能蛋白序列中找出有免疫原性的抗原表位或抗原决定簇,作为免疫原来研究抗SARS疫苗。运用生物信息学技术对抗原蛋白的抗原表位进行预测,是确定抗原表位最有效的方法。S蛋白(Spikeprotein)是位于SARS2CoV表面的一种重要的结构蛋白,在病毒与宿主细胞表面受体结合及介导膜融合并进入细胞的过程中起关键性作用[3],包含病毒与宿主细胞膜受体的结合位

点和主要的中和抗原,是进行抗SARS疫苗设计的重要位点[4]。我们运用生物信息学技术对S蛋白的抗原表位进行预测分析与设计,并合成出设计的候选抗原表位多肽用于免疫家兔,检测分析免疫家兔抗体的产生情况,以发现S蛋白的抗原表位。1　材料与方法

1.1　试剂　Fmoc-氨基酸、HBTU、HOBt(吉尔生化

有限公司),哌啶

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、N-甲基吡咯酮、二氯甲烷(ABI公司),三氟乙酸(Sigma公司),牛血清白蛋白(上海伯奥生物科技有限公司),马血清(GibcoBRL公司),羊抗人IgG(Sigma公司),对硝基苯磷酸盐(pNPP,Sigma公司),96孔酶联板(Corning公司)。1.2　仪器　多肽合成仪(433A,ABI公司),液质联用仪(API?2000,ABI公司),高效液相色谱仪(Al2liance2695,Waters公司),冷冻干燥机(Labconco公

①基金项目:广东省科技厅科研攻关项目SARS专项基金。

②作者简介:张嘉杰(1967-),男,湖南保靖人,在读博士研究生,助理研究员。研究方向:免疫药理学。Tel:13660019832;E-mail:jydyys

@http://wendang.chazidian.com

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司),酶标仪(650,Bio-Rad公司)。蛋白抗原性相关的参数进行预测与分析,结果表明

1.3　动物　新西兰家兔体重为2～3kg,♂(第一军在S蛋白中存在一个球状结构区域(S1区)和3个医大学动物试验中心提供,动物合格证号2003A058)。螺旋区(S2区),螺旋结构分别位于残基729～769,1.4　软件工具　Proteomicsandsequenceanalysistools880～1015,1163～1184。S蛋白的信号肽切割位(http://wendang.chazidian.com/)。点预测结果表明其位于N-端的13位氨基酸残基

(G1.5　方法ly)和14位氨基酸(Ser)残基之间,即1～13位氨1.5.1　抗原表位多肽的预测与设计　利用Expasy

基酸残基为S蛋白的信号肽。S蛋白在1196～1218之间存在一段穿膜螺旋结构,1～1195段处于胞

提供的网络共享工具软件,提交S蛋白的氨基酸序

列在网上对S蛋白的二级结构、信号肽切割位点、穿

β膜螺旋、N-糖基化位点、亲水性、可及性、2转角等

进行预测。综合上述预测结果,设计抗原表位多肽。1.5.2　抗原表位多肽的合成　设计的2个抗原表位多肽采用Fmoc-butyl固相合成侧链保护策略,肽合成仪上进行合成,选用HBTU/HOBt剂。粗肽在HPLC1氟乙酸/HPLC纯度95%以上)谱分析以确定结构1.5.3　家兔免疫　采用浓度为1mg?ml-1的抗原多肽对家兔进行免疫。初次免疫采用剂量为抗原多肽和弗氏完全佐剂(CFA)各1ml,双后足掌及背部各2点sc。加强免疫剂量为抗原多肽和CFA或弗氏不完全佐剂(IFA)各0.5ml,间隔2周加强免疫一次,2种佐剂交替应用,皮下淋巴结注射。在第3次免疫后,每次免疫10d后进行耳静脉采血10ml,分离血清采用间接ELISA法测定免疫血清的抗体效价。1.5.4　ELISA法检测抗体　用0.05mol?L-1碳酸盐

μ缓冲液(pH9.6)的包被液将抗原多肽按100l/孔包

μgml-1,4℃被96孔酶联板包被,浓度20过夜;次日洗涤3次,洗涤液为含0.05%Tween-20的0.02mol

?L-1的PBS(pH7.4);用含10%马血清的洗涤液作为封闭液封闭60min后,再洗涤3次;分别加入按1∶25,1∶100,1∶400,1∶800,1∶1600,1∶3200稀释的免疫

μ家兔血清100l,免疫前家兔的血清作为阴性对照,37℃孵育60min;洗涤3次,加入羊抗人IgG-

膜外,1219～1255则在胞膜内蛋白共有23个N

糖基化位点,其中有10。S,,即75～95,372～478,481～515,610～825,1095～1140,1202～1242。7个亲水性较高的区域,即166～212,260～348,367～470,507～572,749～772,1118～1152,1229～1252。S蛋白在残基459～470存在明

显的β2转角。综合考虑上述预测分析结果,设计了表1中的2个片段作为抗原多肽进行研究。

表1　抗原表位多肽的氨基酸序列

Tab1　Aminoacidsequencesofepitopepeptides

序号

SV21SV22

位置

348～380434～470

氨基酸序列

CVADYSVLYNSTFFSTFKCYSVSATKLNDLCFSGNYNYKYRYLRHGKLRPFEDDISNVPFSPDGKPC

相对分子质量

3726.74048.2

2.2　家兔免疫与抗体的检测　家兔第1次免疫后,

即有免疫反应产生,出现淋巴结肿大现象,随后的加

强免疫部位均在淋巴结上。第3次免疫后10d进行第1次采血,并进行抗体的ELISA检测。结果表明抗体产生的滴度不高。继续免疫后,抗体滴度不断上升,至第6次免疫后,产生抗体的滴度与第5次基本相同,产生抗体滴度达到最大,停止免疫。第6次免疫后,ELISA检测抗体产生的结果见图1、2。检测结果表明免疫后的家兔血清呈明显的阳性反应,稀释3200倍后仍然呈阳性反应。3　讨论

μAP100l,37℃孵育60min,加入底物对硝基苯磷酸盐,37℃孵育10min,终止反应,于酶标仪上测定

450nm处的吸收度。2　结果

2.1　抗原表位多肽的设计　SARS2CoV的S蛋白是

既往对蛋白抗原表位的确定,是通过顺序重叠

合成整个抗原蛋白的多肽片段

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,然后,再进行免疫反应检测来进行。这种方法很准确,但却需要大量的试验时间和费用。近年来,运用生物信息学技术对功能蛋白的抗原表位进行预测,为抗原表位的确定节约了大量的时间和经费,大大提高了试验的预见性和成功率。预测分析主要包括与蛋白抗原性相关

β的二级结构、可及性、亲水性、2转角、信号肽切割位

病毒表面最大的结构蛋白,其由1255个氨基酸残

基组成。根据全基因测序结果翻译的S蛋白的氨基酸序列,利用Expasy提供的网络共享工具软件对S

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?42抗原表位多肽时应该尽量避开这些糖基化可能性高

的位点。综合上述预测与分析结果,我们设计并合成了SV21和SV22作为抗原表位多肽进行研究。

家兔的免疫试验表明,笔者设计合成的抗原多肽均产生了其特异性抗体。说明SV21和SV22中存在S蛋白的抗原表位,证明通过生物信息学方法进行抗原表位的研究是一种很有效的方法,为抗SARS的多肽疫苗深入研究提供了新的试验依据。对SARS2CoV最新的研究成果表明,S蛋白以其318～510共193ACE2(angiotensin

6-,S蛋白的受21和SV22在家兔体内产生的抗SARS2CoV,还需要进一步研究。

参考文献:

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-livecaninecoronavirusvaccineindogs[J].VetMicrobiol,2004,99(1):43

[3]　RotaPA,ObersteMS,MonroeSS,etal.Characterizationofanovel

coronavirusassociatedwithsevereacuterespiratorysyndrome[J].

Science,2003,300(5624):1394

图1　SV21免疫家兔血清抗体的　图2　SV22免疫家兔血清抗体的滴度　

滴度

Fig1　Titrationofantibodiesfrom　Fig2　TitrationofantibodiesfromrabbitserumimmunizedwithSV21　rabbitserumimmunizedwithSV22

点、穿膜螺旋、N-糖基化位点等。SS1球状结构,位于病毒的最外层过S1,液中呈伸展状态,有更多的机会与宿主细胞结合。同时具有较好的亲水性和可及性的片段更易于接近宿主细胞受体和游离的抗体分子。因此,笔者认为位于S1区的3个片段(303～338,372～393,451～470)包含抗原表位的可能性很大。脯氨酸侧链是疏水性的,但因其善于制造转角,而常常在蛋白的表面

2转角预测结果表明466位的脯氨出现。S蛋白的β

酸(Pro)制造了一个明显的β2转角,属脯氨酸转角类型。在抗原表位的筛选和确定时,脯氨酸是一个重要的氨基酸。S蛋白的信号区,是一疏水性的肽段。该肽段在S蛋白通过内质网转运的过程中脱离,不构成S蛋白的抗原表位。1196～1218之间的一段穿膜螺旋结构和1219～1255的胞膜内区由于不可能与宿主细胞结合,也不构成S蛋白的抗原表位。预测的S蛋白23个糖基化位点中有10个位点的糖基化可能性很高,为了避免糖基化的影响,在设计合

[4]　GallagherTM,BuchmeierMJ.Coronavirusspikeproteinsinviralentry

andpathogenesis[J].irology,2001,279(2):371

[5]　LiW,MooreMJ,VasilievaN,etal.Angiotensin-convertingenzyme

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SARScoronavirusSproteinefficientlybindsangiotensin-convertingenzyme2[J].JBiolChem,2004,279(5):3197

(收稿日期:2004-09-01;修回日期:2004-11-15)

(本文编辑　梁爱君)

文章编号:1008-9926(2005)01-0042-05　　中图分类号:R965.1　　文献标识码:A

化学性及免疫性肝损伤模型的方法学研究

黄正明②,杨新波③,曹文斌,陈红艳③,李　壮④

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