高通量SNP基因分型技术研究进展

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高通量ＳＮＰ基因分型技术研究进展

方唯意综述姚开泰审阅

中南大学湘雅医学院肿瘤研究所（长沙，４１００７８）

摘要在后基因组时代，单核苷酸多态性研究已迅速成为了生物医学许多领域的焦点。发展可靠、敏感、经济、稳定、高通量的ＳＮＰ基因分型技术已迫在眉睫。本文主要着重于高通量ＳＮＰ基因分型技术的原理、干Ⅱ弊以及这些技术在这个领域过去几年中的进展。

关键词高通量；单核苷酸多态性；基因分型

单核苷酸多态性（ＳＮＰｓ）是最普遍的遗传变异荧光信号能被检测到。该反应既没有单独的预扩增步骤，也没有中间的处理过程，因此它们是一种最简型大规模相关研究，有助于鉴定许多复杂疾病原因，单的分析方法。由于没有适合这些方法的３８４孔荧了解个体对各种药物的耐受性和对环境因子的反光检测器，以及荧光标记探针的价格过高和缺乏可应。人类基因组测序的完成和１４２万个ＳＮＰｓ在基靠的自动化基因型呼叫软件，因此阻碍了这些方法因组上的定位。“，为首次在全基因组水平上进行的发展。最近，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司新开发的ＳＮＰｓ研究打开了方便大门。经典的ＳＮＰｓ分析方法７９００ＨＴ型高通量荧光定量ＰＣＲ仪，使得进行３８４是ＰＣＲ扩增后用凝胶电泳检测，虽然可靠性好，但孔微滴定平板荧光检测成为了可能，这主要归因于缺乏效率。寡核苷酸微阵列和其他高通量筛选技术高通量能力的增加和反应容积的减少。当如果要发效率有了明显的提高，但临床应用绝非可靠，因此，展更高的基因分型通量时，一个可靠的自动化等位有必要改进和发展新的可靠、敏感、高通量、经济、稳基因呼叫能力是必须的，它不只是纠正基因型呼叫定的ＳＮＰｓ基因分型技术。在本文中，我们主要阐信号更快，而且在处理和加工数据上必须更迅速，更述高通量ＳＮＰｓ基因分型方法，包括一步均质法、焦准确。近来研究表明，自动化基因型呼叫在无阳性磷酸测序、ＤＮＡ芯片／阵列分析法、微球法、ＭＡＬＤＩ—对照情况下进行聚类分析是可行的”１。

状态和将来潜力。

２焦磷酸测序Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ

１一步均质法

焦磷酸测序是对短到中等长度的ＤＮＡ序列样品进行高通量、精确和重复性好的分析方法。其反Ｔａｑｍａｎ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ分析和分子灯塔组成了微滴应原理是当测序引物与ＰＣＲ扩增的，单链ＤＮＡ模定平板荧光阅读系统。Ｔａｑｍａｎ和分子灯塔都依赖板杂交，和各种酶包括ＤＮＡ聚合酶、ＡＴＰ硫酸化酶、于等位基因特异性寡核苷酸杂交在ＰＣＲ期间对等荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、以及底物、荧光素位基因进行区分。而Ｓｃｏｒｐｉｏｎ分析能使用等位基因一起共同孵育。４种ｄＮＴＰ之一被加入反应体系，如特异性ＰＣＲ或是等位基因特异性杂交反应“１来区与模板配对，该ｄＮＴＰ与引物的末端形成共价键，分等位基因。它们作为一个末端分析能在一个完全ｄＮＴＰ的焦磷酸基团释放出来。ＡＴＰ硫酸化酶在均质的反应条件下进行分析。在反应起始，所有试ＡＰＳ存在的情况下催化焦磷酸生成ＡＴＰ，ＡＴＰ驱动剂和基因组ＤＮＡ都混合在一起，经热循环步骤后，

荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，氧化

形式。通过开展具有明显表型特征的ＳＮＰｓ基因分ＴＯＦ贯谱基因分型分析法等，讨论这些技术的目前　

３３４

荧光素发出的可见光信号与ＡＴＰ量成正比。ＡＴＰ和未掺人的ｄＮＴＰ由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，光信号淬灭，并再生反应体系，然后再加另一种ｄＮＴＰ继续反应。焦磷酸测序最初作为ＤＮＡ测序方法而发展起来的，其化学反应与Ｓａｎｇｅｒ双脱氧二核苷酸法完全不同。它无需灌胶、毛细管电泳，也无需同位素或荧光染料的一种测序技术。由于该法阅读侧翼序列和ＳＮＰ位点本身．以及其高度特异性（非特异性结合不产生假阳性信号）使得焦磷酸测序成为一种具有吸引力和准确的ＳＮＰ基因分型方法。焦磷酸测序除了提供高准确性、灵活性以及并行处理过程外，焦磷酸测序很容易实现全自动化的基因分型。

目前．Ｐｙｍ”ｑｕｅｎｃ吨ＡＢ公司已开发了适合于９６孔

中通量和３８４孔全自动化高通量的仪器，后者有能力每天进行数万个基因分型。焦磷酸测序与一些标准基因分型方法相比，还有一些不利方面，即ＰＣＲ反应时生物素标记引物价格较高，以及这种分析需要特殊仪器。目前新研发ｒ几种技术，旨在减少焦磷酸测序前的费用，主要是在模板制备方面，包括标准固相模板制备、三引物的固相模板制备和酶解模板制备”。。Ｆ＇ｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＡＢ公司发展、制造和销售研究产品，这使得生命科学研究者能更有效地得到大规模基因组信息” 。

３

ＤＮＡ芯片／阵列分析

当ＤＮＡ芯片的技术开始出现时，它通过使用一

个简单的等位基因特异性杂交检测技术为高度并行基因分型带来了巨大的希望。然而到目前为此，以等位基因特异性杂交为基础的ＤＮＡ芯片使用数量受到了一定的限制，主要是因为等位基因特异性杂交很难获得良好的信噪比。在杂交反应中，完全匹配和非完全匹配的寡核苷酸区分的特异性受到了一定的限制，与ＤＮＡ聚合酶或连接酶参与的区分反应相比，其特异性更低。当许多不同的寡核苷酸如在同一条件下进行杂交反应时，这种特异性问题将变碍更加突出。尽管过去几年里想了很多的方法，其中包括高冗余芯片技术，但解决特异性这个问题一直并非易事。由美国Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ公司研发的寡核苷酸ＳＮＰ芯片就是利用寡核苷酸与ＤＮＡ完全和不完全互补所造成的这种杂交在热稳定性上的差异来分析ＳＮＰ。近￡二来在Ｎａｃｒｅ和Ｓｃｉｅｎｃｅ发表的一些文章，就采用了这一芯片。但这种芯片最大的缺点就是可靠性较差，对ＳＮＰ位点较少分析时，该芯片可使误差小于Ｉ％，位点较多时，仅假阳性便可高达４０％．这样的误差在临床应用时是绝对不允许

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的”。。鉴于目前ＳＮＰ芯片研究状况和理论上对ＳＮＰ芯片的需求，Ｚｈａｎｇ和“¨ｏ开发了一种新的技术，即３’末端标记引物延伸法。它主要是利用聚合酶式反应原理，应用碱基特异性引物３’末端标记ＰＣＲ的设计方案研发了一种进行ＳＮＰ分析的芯片，这一技术的原理是将不配对的碱基置于３’末端或次３’末端。这一设计的巧妙之处在于标记物或者说可检测信号，永远只会来源于完全配对的引物。

单碱基延伸与固相结合的寡核苷酸联合现已成功运用于微阵列ＳＮＰ并行分析”１。该方法与等位基因特异性杂交平台相比，由于ＤＮＡ聚合酶在结合互补反应中高保真性作用，其特异性信号更强。这种方法的一个变化是在引物３’末端结合变异等位基因去检测等位基因特异性延伸。基因标记分型法不断的发展，并能克服固相反应中对它的一些限制。在这个系统中，一个高度多重单碱基延伸反应使用

５

７端标记序列、荧光标记的双脱氧二核苷酸的引物

在溶液中进行。引物中的标记序列本身并没有参与单碱基延伸反应，而是随后参与了与ＤＮＡ芯片中的寡核苷酸结合。以固相单碱基延伸为基础的标记阵列分析方法有如下优点：①由于价格的降低和它在不同ＳＮＰ基因分型分析中使用相同ＤＮＡ芯片的能力，普通ＤＮＡ芯片也能够使用。②在溶液中可进行酶学反应。③因在寡核苷酸末端没有３’ＯＨ残基的存在，故在ＤＮＡ芯片中应用时很少受到限制。总之，标记阵列和单碱基延伸或基于连接酶解反应的联合运用提供了超高通量分析潜力的基因分型平台。一些公司如Ａｆｆｍｅｔｒｉｘ等一直致力于开发标记阵列基因分型系统。

４微球（Ｂｅａｄ—Ｂａｓｅｄ）法

这种分析方法是非常类似于ＤＮＡ芯片分析方法，其区别在于微球法寡核苷酸粘附于直径３—５

岬的微球体上，而不同于ＤＮＡ芯片，固定在表面。

微球法能与用于ＤＮＡ芯片标记阵列的大部分等位基因区分反应相结合，如单碱基延伸反应和寡核苷酸连接反应。它在多重性和ＳＮＰ联合上有着巨大的灵活性。在微球法分析中，每一个微球体的身份都需要被确定，而且，这种信息将与来自于微球体的基因型信号相结合后指派一个基因呼叫信号到一个ＳＮＰ中去。因此，有必要对每个微球体进行分子鉴定和分类。

一个使用荧光编码的微球体基因分型平台已由Ｌｕｍｉｎｅｘ公司开发出来。这些微球体由两种不同的染料（红色和绿色）所包被，能基于微球体表面上两

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种染料的量多少，能通过流式细胞仪鉴定和分离。如果有１００不同信号比（红色／桔黄色）类型的微球体，那么有可能在一个反应管中做１００次检测。反应后，这些微球体被荧光检测器区分，而且，每一组的微球体的基因分型信号都受到单独的检测。实质上，每一根反应管相当于ＤＮＡ芯片上的１００个位点。现在，由于９６孔流式荧光检测器的出现＋在技术上有可能于９６孔格式反应中对数千个基因型进行记分。这种以微球体平台为基础的技术已经开始与寡核苷酸连接反应‘“、等位基因特异性杂交““、单碱基延伸法““和等位基因特异性引物延伸”“联合应用。尽管这种分析系统已经获得了合理高通量，但是，仍有一些因素限制了该系统向更高通量发展。目前用于微球体检测的染料数目联合被设定在１００一ｐｌｅｘ。另外的限制因素是能够使用于基因分型信号染料的数量。

由ｌｌｌｕｍｉｎａ公司开发的多种商业化柱子平台，它是由光学纤维制造出来的，微球体在固体孔中被捕获ｏ…。每一个孔只适合一个微球体。当微球体固定在这些孔中，这个系统便可作为一张高密度微阵列来对待。在某种意义上说，ｌｌｌｕｍｉｎａ微球体系统更象ＤＮＡ芯片平台。使用这种方法，５００００个微球体能装配成一张微阵列片上。这些特征使得光学纤维微球体阵列系统有一个非常高的多重性潜力。

５质谱基园分型分析

这种方法的原理是使用质谱直接或间接检测等位基因特异性延伸区分反应产物”“。各种等位基因区分反应如单碱基延伸及其变化形式ｏ“、等位基因特异性肽核酸（ＰＮＡ）、Ｉｎｖａｄｅｒ、碱基特异性裂解。”１和等位基因特异性ＰＣＲ已成功的和质谱检测法联合应用。单碱基延伸或其修饰形式与基质辅助激光吸收／离子飞行时间（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）质谱结合已被广泛的应用，并已被一些公司（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）发展为商业性产品。ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ质谱检测的优点在于其速度和多重性能力。例如一个中等质谱检测器Ｉ

ｄ

能记录４万个光谱，理论上５－ｐｌｅｘ检测格式能对２０万基因型进行记分。然而，它们的限速步骤不是质谱仪的检测过程，而是酶学反应之前和反应后样品处理过程。在大部分质谱分析方法中，５－ｐｌｅｘ反应或许是为获得多重性可靠信号现实的制约，部分是由于检测质谱的范围以及质谱区分的敏感性所致。反应后样品处理过程比其它基因分型格式更复杂，因为质谱检测仪对分析样品的纯度要求非常高。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ的ＭａｓｓＡｌｒａｙ自动化系统是利用离子交换

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树脂于对样品进行固相纯化，而Ａｐｐｌｉｅｄ

Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ

是通过微型逆相液化层析进行样品纯化的。另一个分析系统即“ＧＯＯＤ分析系统”＂”在反应中涉及到使用化学修饰引物，然后酶解去掉未延伸的引物以及修饰产物烷化，这样使得用于质谱检测的样品制备简单、经济和有效。另外，烷化产物也能增加质谱检测分析的敏感性。

由于质谱分析内在本质使得基因分型准确性非常高是它又一个优点。质谱分析的敏感性、每个反应产物的高特异性以及对一些类型的反应来说．每个反应都有内部的校正标准，所有这些都归因于质谱分析的准确性。特别是当直接检测等位基因区分产物时，质谱分析法背景很少，允许精确的自动化基

因呼叫。

在当今所有商业化可得到的基因分型系统中，质谱基因分型分析通量是最高的，它是将来在整个基因组相关研究中超高通量基因分型的主要竞争者。

６温控高效液相色谱法ＴｍＩｔＰＬＣ

１９９５年，Ｏｅｆｎｅｒ等用温控高效液相色谱法（Ｔｍ—ＨＰＬＣ）即（ＤＨＰＬＣ）筛选ＤＮＡ序列多态性。ＴｍＨ—ＰＬＣ用于基因突变筛检的主要工作原理是通过离子反相ＨＰＬＣ检测不完全匹配的杂合双螺旋ＰＣＲ产物。发生突变的基因片段在变性温度下与野生型片段发生不完全配对，从而形成完全配对的野生型、完全配对的突变型和不完全配对的杂合型ＰＣＲ扩增片段。在部分变性温度（Ｔｍ）下，通过一定的梯度洗脱使不同类型的片段在分离柱中得到分离。出现突变的ＰＣＲ片段用紫外检测器检测时出现多峰型信号，而野生型表现为单峰型。目前，ＴｍＨＰＬＣ技术发展包括改善检测信号强度与质量、选择更好的分离介质以及提高预测突变性质的能力。随着分离柱专利技术仪器和方法不断改进，ＴｍＨＰＬＣ形成了独特的技术优势。总之，ＴｍＨＰＬＣ通过比较异源双链与同源双链，可以敏感而准确地发现ＤＮＡ变异，只是新发现的变异需进一步测序鉴定。但它能明显减少测序工作量，尤其对鉴别稀少的变异型，可明显降低成本，并加快获取数据的速度。另外，它还具有快速、检出率高（可达９５％～１００％）、适合大片段、ＰＣＲ产物无需纯化，自动化操作等优点。Ｈｕａｎｇ等”“等利用ＴｍＨＰＬＣ在６ｐ２１．３进行鼻咽癌相关基因ＳＮＰ筛选，结果在５个片段中，鉴定了４个新的ＳＮＰ，另外也证实了４个已知ＳＮＰ位点和基因型。目前，该技术在基因突变分析、单核苷酸多态性筛选

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等许多领域里得到了广泛的应用。该技术是一种很有前途的高通量基因分型技术。

诊断和治疗发生革命性的变化。在不久的将来，临床医师能根据病人的遗传图谱，具体的给每一位患者作出正确的诊断，最终给予病人最有效和最方便的药物。

参考文献

１２３４５

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７小结和展望

今天，至少约有２０种不同的ＳＮＰ基因分型方法，其中包含了各种不同的等位基因区分反应和信号检测方法的联合。它们中的许多已经发展为３８４孔板格式和自动化商业产品。基于质谱分析法、标记阵列分析法和一步均质法在高通量基因分型中都有其昆著的优点，它们将是前沿领跑者以带动整个基因组相关研究。一些其它方法如焦磷酸测序等也快速发展以获得更高通量基因分型。然而，由于与质谱分析方法、标记阵列分析法相比较缺乏高度多重性，以及与一步均质法相比缺少额外处理步骤潜力．因此，对：。这些分析方法而言要获得更高通量仍是一个挑战。另外，还有一些其它新出现的方法，如动态等位基因特异性杂交，这种分析是在全自动化的微滴定板中，通过便利的荧光信号检测进行的。该法简单，经济，但它还必须进一步发展装备去参与竞争性高通量平台。

人类基因组计划的实施，产生了大量的ＳＮＰ，生物信息学资源爆炸性的积累，随之推动了ＳＮＰ基因分型新技术的发展。由于高通量基因分型技术的发展，这就使得我们进行大规模的基因组相关研究以及药物遗传学研究成为可能，并将使得现代医学的

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肝细胞生成素家族的分子生物学特性及作用机制研究进展

李英贤贺福初

军事医学科学院放射医学研究所（北京，１００８５０）

摘要人们对肝细胞生成索（ＨＰｏ）及其家族的认识起源于对肝再生现象的研究。越来越多的证据表明，在自然界中存在一个ＨＰＯ家族。近年来，人们对该家族的分子：Ｅ１０Ｒ、ＥＲＶ、９ＧＬ、ｔｔＰＯ等进行了系统的分子生物学研究，该家拱∈的分子具有琉基氧化还原酶的功能，在细胞质内参与二硫键的形成，对细胞的生长、增殖及凋亡具有重要的谓控怍用。

关键诵肝脏再生；巯基氧化酶；信号转导

圈

Ａ

列从人胎肝ｅＤＮＡ文库中获得了人ＡＬＲ（ＨＰＯ）全长ｅＤＮＡ，与大鼠ＡＬＲｅＤＮＡ有８７％的同源性，氨基酸序列有８４．４％的同源性”。。Ｌｉｓｏｗｓｋｙ在１９９２年从酵母中克隆到了一种与线粒体呼吸链的氧化磷酸化及细胞分裂周期调节有关的基因，称其为

ＥＲＶＩ【４Ｊ。最近又从酵母中克隆到了与ＥＲＶｌ同源

人们对ＨＰＯ及其超家族的认识过程起源于对肝再生现象的研究。在１９７５年，ＬａＲｒｅｅｑｕｅ等首次证实了在断乳乳鼠的肝脏和肝部分切除后的大鼠再生肝脏中，存在一种能特异刺激肝细胞ＤＮＡ合成的物质，命名为ＨＳＳ…。１９９４年Ｈａｇｉｙａ等发表了大鼠肝再生增强因子（ＡＬＲ）的分离、纯化与分子克隆的研究结果”Ｊ。杨晓明等根据大鼠ＡＬＲ的ｅＤＮＡ序

的基因ＥＲＶ２。二者氨基酸水平上的同源性达到了