高迁移率族蛋白1HMGB1作为肝癌根治性切除术后预后预测因子的研究

2012年第39卷第10期

高迁移率族蛋白1（HMGB1）作为肝癌根治性切除术后

预后预测因子的研究*

刘芙蓉①

摘要张耀军①陈敏山①彭振维②徐立①林小军①探讨肝细胞肝癌组织中高迁移率族蛋白1（highmobilitygroupbox1，HMGB1）蛋白表达情况及其对肿瘤预后的目的：

影响。方法：收集本院2004年1月至2004年12月期间首次诊断，并行肝癌根治性切除术、术后病理确诊为肝细胞癌、随访资料完整的肝癌患者98例，并收集2009年1月～2010年12月在本院行肝血管瘤切除的肝组织30例作为正常肝脏组织对照，免疫组化法检测肝癌及癌旁组织、正常肝组织中HMGB1蛋白表达情况；并分析HMGB1的表达水平与各临床病理参数的相关性，及其对总体生存率和无瘤生存率的影响。结果：HMGB1主要表达在细胞质中，肿瘤组织表达率为91.84%，癌旁组织表达率为21.43%，正常肝组织无表达。相关性分析显示HMGB1的表达高低与肿瘤包膜的情况存在相关，与其他各临床病理参数均无相关性。全组1、3、5年总体生存率为：83.5%、58.2%、49.4%；无瘤生存率为：60.7%、40.6%、36.8%。Cox多因素分析显示HMGB1表达水平是影响总体生存率、无瘤生存率的独立预后因素；HMGB1高表达组（57例），无或低表达组（41例）1、3、5年生存率分别为75.4%、42.7%、37.7%及89.3%、69.3%、57.5%（P=0.028）；相应的无瘤生存率分别为50.1%、31.6%、26.1%及68.4%、47.1%、45.1%（P=0.047）。HMGB1在肝细胞肝癌组织中呈高表达，其表达水平与肿瘤包膜的完整性呈负相关，HMGB1的高表达是肝癌根治性切除术结论：

后的总体生存率和无瘤生存率的独立预后因素，可以作为肝癌根治性切除术后的预后预测因子之一。

关键词高迁移率族蛋白1肝细胞肝癌预后预测因子doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2012.10.024

ExpressionandPrognosticSignificanceofHMGB1ProteininHepatocellularCarcinomaafterCurativeHepatectomy

FurongLiu1,YaojunZhang1,MinshanChen1,ZhenweiPeng2,LiXU1,XiaojunLin1

Correspondenceto:MinshanChen,E-mail:Chminsh@http://wendang.chazidian.com

1DepartmentofHepatobiliarySurgery,CancerCentreofSunYat-SenUniversity,StateKeyLaboratoryofOncologyinSouthernChina,Guangzhou510060,China

2DepartmentofOncology,TheFirstAffiliatedHospitalofYat-SenUniversity,Guangzhou510060,China

AbstractObjectives:Toinvestigatetheexpressionofhigh-mobilitygroupbox1(HMGB1)inhepatocellularcarcinoma(HCC)ThisworkwassupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30872995)andtoanalyzetheassociationofHMGB1expressionwithclinicopathologiccharacteristicsandprognosis.Methods:Ninety-eightpatientsdiagnosedwithHCCafterpathologicalanalysisreceivedcurativehepatectomyfromJanuary2004toDecember2004.Theircompletefollow-updatawerecollected,andtheywereusedasstudypopulation.Thirtycaseswithhepatichemangiomaresectionwereselectedascontrast.ImmunohistochemistrymethodwasusedtodetecttheexpressionofHMGB1.TheassociationofHMGB1expressionwithclin-icopathologiccharacteristicsandoverallandrecurrence-freesurvivalswasanalyzed.Results:ExpressionofHMGB1wasobservedmainlyinthecytoplasm.HMGB1wasrecordedin90(91.84%)of98tumortissues,21.43%injuxtacanceroustissues,andnoneinnormalhepatictissues.TherewasnocorrelationbetweentheexpressionofHMGB1andclinicopathologiccharacteristics,exceptforthetumorcapsule.The1-,3-,and5-yearoverallsurvivalsof98patientswere83.5%,58.2%,and49.4%,respectively,andthecorrespondingrecurrence-freesurvivalswere60.7%,40.6%,and36.8%,respectively.MultivariateanalysisshowedthatHMGB1wasanindependentprognosticfactorforoverallandrecurrence-freesurvivals.The1-,3-,and5-yearoverallsurvivalratesforthepatientswithHMGB1highexpression(n=

57)andwithnoorlowexpression(n=41)were75.4%,42.7%,and37.7%and89.3%,69.3%,and57.5%,respectively(P=0.028).Thecorrespondingrecurrence-freesurvivalswere50.1%,31.6%,and26.1%and68.4%,47.1%,and45.1%,respectively(P=0.047).Conclusion:TheoverexpressionofHMGB1isaprognosticpredictorforpatientswithHCCaftercurativehepatectomy.KeywordsHigh-mobilitygroupbox1(HMGB1);HepatocellularCarcinoma;Recurrence;Prognosis

肝癌是我国最为常见的恶性肿瘤之一，其发病

率列我国恶性肿瘤发病率的第三位，死亡率的第二

??本文课题受国家自然科学基金项目（编号：30872995）资助通信作者：陈敏山Chminsh@http://wendang.chazidian.com位［1］。手术切除仍然是肝癌最主要的根治性治疗手段，文献报道，肝癌手术切除后5年生存率达50～

作者单位：①中山大学肿瘤防治中心肝胆科，华南肿瘤学国家重点实验室（广州市510060）；②中山大学附属第一医院肿瘤科

高迁移率族蛋白1（HMGB1）作为肝癌根治性切除术后预后预测因子的研究

70%，但是由于肝癌的生物学特性，术后复发率极高，

可高达83.4%，长期生存不理想［2］。寻找发现有效的预测指标，对高危复发的病例进行有效的个体化治疗，降低复发率，是提高肝癌治疗效果的关键，也是肝癌研究的热点。由于肝癌生物学行为的复杂性，目前还缺乏行之有效的预测指标。

HMGB1）是一种非组蛋白DNA结合蛋白，在细胞核

高迁移率族蛋白1（highmobilitygroupbox1，

1材料与方法

1.1一般资料

收集我院2004年1月至2004年12月期间首次

诊断，并行肝癌根治性切除术、术后病理确诊为肝细胞癌、随访资料完整的肝癌患者98例，其中男性85例，女性13例；平均年龄46.7岁（14～70岁）。临床分期根据TNM/AJCC分期标准第七版，Ⅰ期79例，Ⅱ期大径≤5cm55例，>5cm43例；病理分级：高分化543例，ⅢA期16例；多发肿瘤10例，单发88例；肿瘤最例，中低分化44例，其中98例患者肝功能均为Child-PughA级，（表1）。癌旁组织定义为距肿瘤边缘2cm的非癌肝组织共42例。同时选取2009年1月～2010年12月在我院行肝血管瘤切除患者的肝组织30例作为正常肝脏组织对照。肝癌根治性切除的标准为完整切除肿瘤，无瘤切缘>1cm，病理学检查切缘无残癌，且肉眼及镜下均未发现癌栓［6］。

内HMGB1可稳定核小体并调节转录。而细胞出现损伤或死亡时以及一些细胞因子的作用下，细胞可

释放HMGB1［3］。近年来越来越多的研究表明的作用，并且与肺癌、肠癌等的预后密切相关［4-5］。本研究拟观察HMGB1在肝细胞癌组织、癌旁组织、正常肝组织等的表达情况，并探讨其作为肝癌根治性治疗后预后预测因子的可行性。

HMGB1在肿瘤的发生、发展、浸润与转移中起着重要

表198例肝细胞肝癌中HMGB1表达与临床病理特征及预后关系（单因素+多因素分析）

34.50

43

23.80

>5

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USA），为鼠抗人单克隆抗体。二抗为DAKO公司山羊1.3

抗兔/鼠IgG抗体-HRP（辣根过氧化酶）多聚体。

实验方法和评判标准

HMGB1抗体购自Abcam公司（ab77302，Abcamplc.OneMarketSt.Suite3600SanFrancisco，CA94105

1.2试剂来源

信函随访5年以上，末次随访时间截止至2011年6月。全部病例术后2年内每3个月，2年后每6个月返院复查一次，项目包括肝功能、甲胎蛋白（alphafeto?protein，AFP）水平、CT或B超。总生存时间的计算为疾病确诊时间至死亡或末次随访时间间隔。复发时间为手术后至术后第一次发现复发的时间。1.5

统计学方法

采用SPSS13.0软件行统计学分析。临床病理参

将病理组织10%甲醛固定，石蜡包埋连续切片，厚4μm。免疫组化方法采用非生物素二步法，常规50。DAB显色，苏木精复1：300，二抗工作浓度为1：免疫组织化学染色程序进行染色。一抗工作浓度为

数及HMGB1表达水平相关性分析采用Spearman相关分析，采用Kaplan-Meier方法进行单因素分析，计算总体生存率，并采用Log-rank进行显著性检验。采用Cox比例风险模型进行多因素分析。双侧P值<0.05

认为有统计学意义。22.1

结果

HMGB1在肝癌、癌旁组织和正常肝组织中的表

染，脱水，透明，固定。以PBS液代替一抗作为阴性对照，以已知的表达HMGB1的结肠癌组织为阳性对

照。采用双盲法由2位有经验的病理科医生读片，每张切片选择5个有代表性的高倍镜视野，细胞总数超过1000。

免疫组化判断主要根据阳性细胞在全部组织细胞中所占的比例以及阳性细胞染色强度来判定实验结果。①阳性百分数：≤25%（1分），26%～50%（2分），51%～74%（3分），≥75%（4分）；②按染色强度：无染色为阴性（1分），淡黄色为弱阳性（2分），黄色为中度阳性（3分），深棕色（颜色偏深者）为强阳性（4分）。二者同时进行评分后进行相乘后，1～2分为（-），3～4分为（+），6～8分（++），9～12分（+++），16分为（++++）。以≥4为阳性。另外以8分为阶段点，≤8分为无表达及低表达组，>8分为高表达组［7］。1.4随访

所有病例均由住院部或门诊记录，电话随访或

达情况

中。本研究98例肝癌中，评分≥4为阳性，肿瘤组织HMGB1表达率为91.84%（90/98），其中HMGB1无表达者8例，低表达者49例，高表达者41例，肿瘤间质细胞未见HMGB1表达。癌旁组织中HMGB1表达率较低（21.43%，9/42），且仅1例为高表达。正常肝组织中均未见表达（图1）。2.2

HMGB1的表达与临床病理参数之间的相关性

HMGB1主要表达于肿瘤细胞胞质和（或）胞核

采用Spearman相关分析对HMGB1的表达水平与

各临床病理参数进行相关性分析，发现HMGB1的表达

水平与肿瘤包膜之间存在负相关，r=-0.251，P=0.013，

～．

A

达×200图1Figure1100生存率（％）

806040200图2

20

4060

时间/月

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达水平与其余各临床病理参数包括年龄，性别，AFP，肿

说明HMGB1表达水平越高肿瘤包膜完整性越差，而

HMGB1低表达肿瘤包膜完整性越好。但HMGB1的表是影响总体生存率的独立预后因素，即肿瘤≤5cm，TBiL≤17.1μmoL/L，HMGB1无或低表达者术后总体生存率较好。肿瘤≤5cm与>5cm者1、3、5年总体生存率分别为：90.8%、70.4%、60.9%及74.3%、42.3%、34.5%（P=0.004）；TBiL≤17.1μmoL/L与TBiL>17.1μmoL/L者1、3、5年总体生存率为分别为：85.8%、69.1%、59.2%及80.5%、43.9%、36.7%（P=0.032）；HMGB1高表达组，无或低表达组1、3、5年总体生存率为分别为75.4%、42.7%、37.7%及89.3%、69.3%、57.5%（P=0.028，表1、图2）。

瘤大小，肿瘤数目，病理分级及TNM分期等均无相关性，

见表1。

2.3总体生存率及其相关因素分析

胆红素（totalbilirubin，TBiL）水平以及HMGB1表达水平是影响预后的因素。进一步的Cox比例风险模型多因素分析显示肿瘤大小，TBiL水平及HMGB1表达水平

49.4%；单因素分析显示肿瘤大小，肿瘤数目，血清总

全组1、3、5年总体生存率为：83.5%、58.2%、

］

A：HMGB1在肝癌组织中的高表达×200；B：HMGB1在肝癌组织中的高表达×400；C：HMGB1在肝癌癌旁组织中的低表达×200；D：正常肝组织无表

HMGB1在肝癌中的表达，非生物素二步法

TheexpressionofHMGB1inHCC,juxtacanceroustissueandnormalhepatictissue

、

100

B

HMBG1（-～++）删失

HMBG1（+++～++++）删失

‘—Ｌ—

ＨＭ

C

100生存率（％）

806040200图3

20

4060

时间/月

80

100

删失删失

…１

HMBG1（-～++）

＋

D

50.7%、46.5%及43.5%、27.2%、23.8%（P=0.002）；ALT≤40μ/L与ALT>40μ/L1、3、5年无瘤生存率分别为：65.5%、53.8%、49.8%及54.2%、22.7%、18.2%年无瘤生存率为分别为50.1%、31.6%、26.1%及

68.4%、47.1%、45.1%（P=0.047，表1、图3）。

（P=0.009）；HMGB1高表达组，无或低表达组1、3、5

80

98例肝癌患者组织中HMGB1表达与患者总生存时间曲线

Kaplan-Meieroverallsurvivalcurvesof98HCCpatientscate?

HMBG1（+++～++++）

Figure2

gorizedbyHMGB1expressionlevels(-～++)and(+++～++++)

全组1、3、5年无瘤生存率为：60.7%、40.6%、

36.8%；单因素分析显示血清谷丙转氨酶（alanineTNM分期以及HMGB1表达水平是影响复发的主要

2.4无瘤生存率及其相关因素分析

aminotransferase，ALT

）水平，肿瘤大小，肿瘤数目，

98例肝癌患者组织中HMGB1表达与患者无瘤生存时间曲线

Kaplan-Meieroverallsurvivalcurvesof98HCCpatientscate?

因素。进一步的Cox比例风险模型多因素分析显示ALT水平，肿瘤大小以及HMGB1表达水平是影响复HMGB1无或低表达者术后无瘤生存率较好。肿瘤≤发的独立预后因素，即肿瘤≤5cm，ALT≤40μ/L，

Figure3

gorizedbyHMGB1expressionlevels

3讨论

手术切除一直以来是肝癌的首选治疗手段，也

5cm与>5cm1、3、5年无瘤生存率分别为：73.7%、

是肝癌患者获得长期生存的最主要治疗手段。随着

2012年第39卷第10期

肝癌早期诊断的逐渐增多、肝脏外科技术的不断提高和肝癌综合治疗的不断发展，肝癌的切除率逐渐提高。但是研究发现，近几十年来，肝癌切除术后5年生存率并没有显著提高，术后的高复发率是主要原因。因此，发现术后高危复发人群并采取有效的干预措施，是提高肝癌手术切除疗效的关键。简单的临床病理指标已经被证实难于进行有效的筛选，探讨和发现有效的分子生物学指标是其主要的研究方向［2］。

近年来的研究发现，自噬在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。自噬不仅能够使肿瘤细胞在乏氧和营养缺乏的环境中生存，而且与免疫炎症反应、新生血管的生成等有着密切的联系［8-9］。HMGB1是细胞自噬调控的重要因子，具有促进肿瘤细胞自噬从而抑制凋亡的作用，其机制是HMGB1移位至胞质，并与细胞自噬相关蛋白Beclin-1/Bcl-2复合物中解放出来，Beclin-1相互作用，诱导细胞自噬的

使之从

发生［10］。另外，HMGB1是由坏死及受损的细胞分泌，使HMGB1成为一种典型的内源性危险信号，调节肿瘤免疫微环境，从而躲避免疫系统对肿瘤的杀伤作

用；并且可以激活某些细胞（包括肿瘤干细胞）发生增殖，从而导致肿瘤的耐药性和高复发率［11-12］。

研究表明，HMGB1的表达与肿瘤的预后密切相

关［4，5，7］。Wu等［13］的研究发现，HMGB1的高表达和鼻咽

癌的高侵袭性和治疗预后不良密切相关；而Yao等［4］的研究也发现，HMGB1的高表达与结肠癌的肿瘤进展，预后不良相关。我们的研究发现：HMGB1与肝癌根治性切除术后的复发、预后相关，HMGB1高表达组，无42.7%表达及低表达组1、3、5年生存率分别为75.4%、

的无瘤生存率分别为、37.7%及89.3%、47.1%、45.1%（P=0.04750.1%69.3%）。结果说明：、、31.6%57.5%、（26.1%P=0.028HMGB1及）68.4%，相应的高表、达与肝癌根治性切除术后的高复发率相关，从而导致了较低的长期生存率。但其机制还需进一步的研究。此外，多因素分析也发现肿瘤大小，TBiL水平也是影响总生存率的独立预后因素，而肿瘤大小，ALT的水平也是影响无瘤生存率的独立预后因素。相关研究［1，2］表明肿瘤的大小不仅是决定分期的重要因素，而且肿瘤越大时容易合并脉管癌栓及子灶，导致复发及预后不良；我国大部分肝癌患者合并肝硬化，肝功能的情况也是影响肝癌预后的重要因素，TBiL的患者，的水平反应了患者肝功能的情况，ALT及与肿瘤大小、Cheng多预后不良。

肝功能欠佳等［14］的研究发现，血清HMGB1的高表达病理分级、肿瘤TNM分期等存在明显的相关性，肿瘤越大、低分化、TNM晚期的患者，血清

HMGB1HMGB1的表达水平越高。但是我们的研究结果发现

HMGB1的表达仅与肿瘤包膜完整性存在负相关，差，提示表达呈高水平其相应肿瘤包膜的完整性越HMGB1的表达与肝癌的侵袭性之间存在一定关系。但HMGB1的表达水平与其他临床病理参数包括年龄、性别、AFP，肿瘤大小、肿瘤数目、病理分级及TNM分期等均无相关性，其原因可能是：①我们入组的病例都是相对比较早期的病例，并不包括已经出现血管侵犯的病例；②肿瘤组织中HMGB1的表达与血清HMGB1的表达可能并不完全相同，其关系还需进一步研究。最近，Wang等［15］通过对34例肝癌患者的组织进行分析发现HMGB1在肝癌组织中的表达是高于癌旁及正常组织，并与TNM分期，血管侵犯及包膜侵犯具有相关性。这与我们的研究结果一致HMGB1，但因体现。而我们的研究则更进一步的结合了临床随访

与我TNM们的分期及血管侵犯的相关性并未得到研究对象为早中期的患者，所以资料，结果分析发现HMGB1的高表达是肝癌患者根治性切除术后预后不良的独立预后因素。

总之，HMGB1在肝癌组织中呈高表达，其表达水平与肿瘤包膜的完整性负相关，HMGB1的高表达是肝癌根治性切除术后的总体生存率和无瘤生存率的独立预后因素，可以作为肝癌根治性切除术后的预后预测因子之一。通过对肝癌组织中HMGB1的检测，及时发现高危复发患者，有助于实现肝癌的个体化治疗，降低复发率，提高长期生存率。

参考文献

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